益生菌分離株L5和B3抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌感染的作用與機(jī)制研究.pdf

1、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)是20世紀(jì)80年代才引起普遍關(guān)注的一種人畜共患腸道病原菌，也是全球范圍內(nèi)感染性腹瀉常見的食源性病原菌。目前用于臨床治療Y.enterocolitica感染的主要藥物是抗生素，長期不合理使用抗生素進(jìn)行治療不僅會(huì)引起胃腸功能紊亂和消化道微生態(tài)失調(diào)等不良反應(yīng)的問題，而且還會(huì)導(dǎo)致抗生素類藥物的殘留并誘發(fā)致病菌的耐藥性。研究表明，益生菌可以有效治療腸道細(xì)菌性感染，但是機(jī)理尚不完

2、全明確，并且關(guān)于益生菌在預(yù)防和治療Y.enterocolitica引起的人和動(dòng)物感染的報(bào)道較少。乳酸菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacteria）是自然狀態(tài)下動(dòng)物腸道正常菌群中的常見益生菌。研究表明，天然存在于動(dòng)物腸道中的益生菌具有適應(yīng)動(dòng)物胃腸道內(nèi)環(huán)境和可長期定植于腸道等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究旨在從健康動(dòng)物或人腸道中篩選具有良好耐酸、耐膽鹽、耐胰酶、抑菌且具有抗氧化能力的乳酸菌和雙歧桿菌，在建立感染Y.enter

3、ocolitica的BALB/c小鼠模型的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證所篩選的優(yōu)良益生菌的抗Y.enterocolitica感染功能并研究其作用機(jī)理。
　　本研究的主要研究過程如下:首先對(duì)具有感染性的Y.enterocolitica進(jìn)行了分離。在黑龍江地區(qū)的養(yǎng)豬場中采集58份斷奶仔豬腹瀉糞便樣品，經(jīng)過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和分子鑒定，共分離到18株Y.enterocolitica，分別命名為Y1～Y18。采用PCR的方法對(duì)6種毒力基因(ail、v

4、irF、yadA、ystA、ystB、和rfbC)進(jìn)行檢測結(jié)果表明，18個(gè)Y.enterocolitica分離株中10株攜帶ystB基因，3株攜帶ail基因，其余5個(gè)分離株未檢測到毒力基因。隨后用這些分離株進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示這些分離株經(jīng)口感染小鼠和斷奶仔豬，所產(chǎn)生致病性存在很大差異，典型的致病性分離株（含ail基因）中，有的對(duì)小鼠和豬均具有致病性，如Y7;有的則無致病性，如Y17;而典型的非致病性分離株（不含毒力基因），則可以

5、引起小鼠和豬不同程度發(fā)病，如Y9和Y16。此外，這些對(duì)小鼠和斷奶仔豬具有致病性的分離株所引起的發(fā)病情況，如腹瀉程度、持續(xù)時(shí)間和糞便帶菌天數(shù)等，也存在差異，且不同分離株Y7（含ail基因）、Y11（含ystB基因）和Y16（不含毒力基因）感染的斷奶仔豬后，各組仔豬的腸系膜淋巴結(jié)、腸內(nèi)容物和關(guān)節(jié)液等部位中Y.enterocolitica的PCR檢出情況也有所不同。
　　同時(shí)，分別以健康動(dòng)物腸道內(nèi)容物（或糞便）和健康母乳喂養(yǎng)的幼兒糞便為

6、材料，分別以改良MRS選擇性培養(yǎng)基和改良BLM選擇性培養(yǎng)基對(duì)自然狀態(tài)下存在于腸道中的乳酸菌和雙歧桿菌進(jìn)行分離篩選，通過對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察、經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢、觸酶試驗(yàn)、生化試驗(yàn)及對(duì)16SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析等方法對(duì)兩種益生菌進(jìn)行分離和鑒定，并逐步篩選具有耐酸性、耐胰酶、耐膽鹽活性，并且對(duì)致病性金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌具有抑制效果的菌株，隨后測定其體外抗氧化能力。結(jié)果篩選獲得具有優(yōu)良性狀的14株乳酸菌和

7、7株雙歧桿菌共21株益生菌分離株，分別命名為L1～L14和B1～B7。分離株中包括包括7株短乳桿菌(lactobacillus brevis)L1、L2、L4、L5、L10、L11和L12，5株約氏乳桿菌(lactobacillus johnsoii)L3、L6、L7、L9和L14，2株屎腸球菌（Enterococcus faecium）L8和L13，3株嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacteriuminfantis）B1、B5和B7以及

8、4株短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) B2、B3、B4和B6。具有體外耐酸(pH=2)、耐膽鹽(4000mg/L)、耐胰蛋白酶(0.1％)、抑菌活性和抗氧化能力，表現(xiàn)出良好的益生活性，具有被開發(fā)成益生菌制劑的潛力。其中短乳桿菌(lactobacillus brevis)L5和短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) B3表現(xiàn)出較為突出的益生活性，故選這兩株益生菌進(jìn)行后續(xù)的拮抗Y.enterocol

9、itica感染體內(nèi)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。
　　最后，分別建立以Y.enterocolitica分離株Y16（T1組）和Y.enterocolitica模式菌株ATCC9610經(jīng)口感染的小鼠模型(T2組)，用短乳桿菌L5灌喂7天后再經(jīng)口感染感染Y16（L1組）和模式菌株ATCC9610（L2組）的小鼠模型，以及用短雙歧桿菌B3灌喂7天后再經(jīng)口感染感染Y16(B1組)和模式菌株ATCC9610（B2組）的小鼠模型。通過對(duì)體重變化的檢測，對(duì)盲腸內(nèi)

10、容物和糞便進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，血清中IgG和腸粘液中sIgA的含量的檢測，組織病理變化的觀察，體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)和酶水平的檢測、腸黏膜屏障相關(guān)功能基因mRNA水平的檢測和與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平的檢測，對(duì)短乳桿菌L5和短雙歧桿菌B3拮抗Y.enterocolitica感染的能力及其機(jī)制進(jìn)行評(píng)價(jià)和研究。
　　結(jié)果顯示，短乳桿菌L5和短雙歧桿菌B3連續(xù)灌喂后可明顯緩解Y.enterocolitica感染所引起的小鼠體重減少的

11、現(xiàn)象，并降低小鼠盲腸內(nèi)容物中的Y.enterocolitica細(xì)菌數(shù)，同時(shí)增加糞便中排菌數(shù)。灌喂短乳桿菌L5和短雙歧桿菌B3使腸道中針對(duì)Y.enterocolitica的sIgA含量明顯增加，而血清中相應(yīng)IgG的含量則降低。相比于直接感染Y.enterocolitica的T組小鼠，L5和B3灌喂組的小鼠的十二指腸、空腸和回腸腸絨毛固有層中的炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕或消失。L5和B3灌喂組相比于Y.enterocolitica感染組，小鼠

12、體內(nèi)僅有少量氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物MDA（丙二醛），且含有高水平的抗氧化酶GSH（谷胱甘肽過氧化物酶）、SOD（總超氧化物歧化酶）和CAT（過氧化氫酶）的水平升高。L5和B3的灌喂組的小鼠，體內(nèi)促炎因子如IL-6、IL-17a和INF-γ等的mRNA的水平降低，而IL-4和IL-10等抑炎因子和腸道緊密連接蛋白OCLN的mRNA的含量則升高，此外，相比于T組，灌喂L5和B3組的小鼠體內(nèi)p38和NF-κB蛋白的表達(dá)量明顯降低。
　　本研

13、究進(jìn)一步證實(shí)了益生菌是Y.enterocolitica腸道感染的潛在治療方式，且發(fā)現(xiàn)了益生菌在體內(nèi)的抗氧化作用和刺激腸道特異性sIgA的分泌增多的功能，結(jié)合信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化推測益生菌可能通過影響信號(hào)通路蛋白表達(dá)而發(fā)揮一系列調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和抵抗病原菌感染的作用，且在腸道致病菌的感染中中，益生菌的體內(nèi)抗氧化功能和刺激腸道sIgA分泌的現(xiàn)象可能是益生菌拮抗病原菌感染的新機(jī)制。本研究結(jié)果可為益生菌治療或預(yù)防腸道細(xì)菌感染的機(jī)制的研究提供新的數(shù)