RovM 和 RovA 調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌生物被膜形成和毒力的分子機制研究.pdf

1、鼠疫耶爾森氏菌是（Yersinia pestis,以下簡稱“鼠疫菌”）是引發(fā)烈性傳染病鼠疫的病原菌，是一種革蘭氏染色陰性的短小桿菌。而且，鼠疫菌在不同的培養(yǎng)條件或宿主環(huán)境下會呈現(xiàn)不同的形態(tài)。鼠疫菌染色體基因組大小約為4.65 Mb，包含約4000個基因。大多數(shù)的鼠疫菌菌株都包含3種質(zhì)粒：pPCP1，pCD1和pMT1，3種質(zhì)粒上包含有大量重要的毒力因子，對于鼠疫菌在宿主體內(nèi)生存、傳播以及致病有著重要意義。鼠疫菌進入人體后，感染初期會在幾

2、天內(nèi)迅速擴散至人體的淋巴結(jié)形成腺鼠疫（bubonic plague）；一旦進入血液經(jīng)大量繁殖后容易引發(fā)敗血癥鼠疫（septicemic plague），并進一步擴散至脾、肝、肺等器官和組織；最終，一部分患者會發(fā)展為肺鼠疫（pneumonic plague），病原菌可以直接通過空氣傳播給其他人，易傳播且致死率高。鼠疫菌引發(fā)的烈性傳染病曾在世界范圍內(nèi)引發(fā)3次大流行，給人類帶來了深重的災(zāi)難，并在一定程度上影響了各民族的政治、經(jīng)濟和文化。而且，

3、近些年來世界衛(wèi)生組織（WHO）將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。鼠疫防治的研究工作仍然顯得十分重要。
　　鼠疫菌由其祖先假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis，以下簡稱“假結(jié)核菌”）進化而來，然而完全區(qū)別于假結(jié)核菌的傳播方式，在自然界中，鼠疫菌通過節(jié)肢動物跳蚤的叮咬在宿主動物間進行循環(huán)傳播，攜帶病原菌的跳蚤偶然間叮咬到人類會引發(fā)人間鼠疫。鼠疫菌在跳蚤體內(nèi)傳播時，會形成致密的生物被膜堵塞跳蚤的前胃，形成所

4、謂的“菌栓”，使得跳蚤吸食的血液無法進入胃內(nèi)消化，跳蚤時刻處于饑餓狀態(tài)，反復(fù)叮咬宿主從而促進了鼠疫菌的傳播。因此，鼠疫菌生物被膜的產(chǎn)生對于其經(jīng)蚤傳播的能力是具有重要意義的。
　　鼠疫菌擁有復(fù)雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制著各個生物被膜形成決定性因子以及毒力因子的激活和抑制，這其中各級調(diào)控子的協(xié)同作用對于鼠疫菌的致病和傳播有著重要意義。目前的研究表明，許多重要的調(diào)控子以及它們調(diào)控的靶標基因在鼠疫菌生物被膜形成以及病原菌致病性中扮演著重要角色

5、。鼠疫菌中hmsHFRS操縱子坐落于染色體上的pgm位點內(nèi)，負責(zé)合成和運輸多聚β-1,6-N-乙酰-D-氨基葡糖（poly-β-1,6-N-acetylglucosamine exopolysaccharide）類似的多糖化合物，是生物被膜基質(zhì)的主要成分，與鼠疫菌菌落能否被剛果紅染料染色有直接關(guān)系。環(huán)二鳥苷單磷酸（c-di-GMP）是一個在細菌內(nèi)廣泛存在的第二信使分子，影響細菌毒力因子的表達和生物被膜形成。在鼠疫菌內(nèi)，HmsT和HmsD

6、是僅有的兩個鳥苷酸環(huán)化酶能夠催化c-di-GMP的合成，從而促進生物被膜的形成。然而，HmsP是鼠疫菌中唯一催化降解 c-di-GMP的磷酸二酯酶，從而抑制鼠疫菌生物被膜的產(chǎn)生。在革蘭氏陰性菌中，脂多糖（Lipopolysaccharide）是構(gòu)成外膜必不可少的主要成分。一般來說，脂多糖由三部分組成：脂質(zhì)A，核心多糖（Kdo）和O抗原，而鼠疫菌的脂多糖僅由脂質(zhì)A在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下與Kdo連接。在鼠疫菌中，waaA, waaE和coaD

7、構(gòu)成一個三基因的操縱子waaAE-coaD。waaA編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶催化Kdo連接到脂質(zhì)A上，而waaA缺失后的鼠疫菌也表現(xiàn)出明顯的生物被膜形成缺陷。waaE編碼的蛋白對于核心多糖鏈內(nèi)庚糖的修飾起到關(guān)鍵作用，而研究表明 waaE缺失后體外培養(yǎng)細菌時生物被膜形成約有40％左右的降低。這說明了鼠疫菌生物被膜的形成和脂多糖的合成有著重要聯(lián)系。在鼠疫菌中，pH6抗原是重要的黏附因子以及毒力因子。pH6抗原的合成和分泌需要兩個相鄰的操縱子基因簇的

8、參與，即psaABC和psaEF。psaEF可以編碼調(diào)控子蛋白促進psaABC的表達。重要的毒力調(diào)控子RovA和PhoP可以通過直接結(jié)合psaABC和psaEF的啟動子區(qū)結(jié)構(gòu)，分別激活和抑制它們的表達。pH6抗原可以通過介導(dǎo)鼠疫菌黏附到肺泡上皮細胞，對于鼠疫菌引發(fā)小鼠腺鼠疫和肺鼠疫的發(fā)生都有重要的貢獻。
　　RovA是 MarR/SlyA家族的調(diào)控子，影響著許多細菌大量毒力基因的表達，在三種致病型耶爾森氏菌的毒力基因調(diào)控中都扮演重

9、要角色。許多MarR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，例如表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的TcaR，屎腸球菌（Enterococcus faecium）的AsrR，變異鏈球菌（Streptococcus mutans）的RcaR以及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SarZ/SarA等，都有研究報道影響細菌生物被膜的形成，然而RovA對于鼠疫菌生物被膜形成的調(diào)控機制還是未知的。RovM是

10、LysR家族的一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，它首次被發(fā)現(xiàn)是在假結(jié)核菌中，研究表明RovM可以直接結(jié)合到rovA基因的啟動子區(qū)并抑制其轉(zhuǎn)錄，而且RovM影響假結(jié)核菌的侵襲能力、毒力及運動性等。許多LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，例如菊歐文氏菌（Erwinia chrysanthemi）的PecT，胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）以及大腸桿菌（Escherichia coli）的LrhA，都在細菌毒力及生物被膜基因調(diào)控方面影響重大。那

11、么，RovM在鼠疫菌毒力及生物被膜形成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中又扮演怎樣的角色呢？
　　本研究中，以RovM和RovA兩個調(diào)控子作為主要的研究對象，通過生物被膜形成檢測的相關(guān)表型實驗如：結(jié)晶紫染色半定量實驗、線蟲蟲卵發(fā)育實驗、菌落表面形態(tài)觀察等實驗方法探究RovM和RovA對鼠疫菌生物被膜形成的影響。結(jié)果表明：RovM能夠促進鼠疫菌生物被膜的形成，而RovA卻抑制鼠疫菌生物被膜的形成。通過檢測并比較鼠疫菌不同菌株之間細菌胞內(nèi)c-di-GM

12、P的含量探究RovM和RovA是否影響第二信使分子c-di-GMP的合成。結(jié)果表明：RovM顯著地激活c-di-GMP的合成，而RovA卻強烈地抑制c-di-GMP的合成。通過皮下感染以及靜脈感染兩種方式給小鼠注射鼠疫菌，繪制小鼠生存曲線來探究RovM對鼠疫菌毒力的影響。結(jié)果表明：RovM抑制鼠疫菌的毒力。在獲得了表型實驗結(jié)果后，進一步通過精細的基因調(diào)控實驗如：引物延伸實驗、實時定量熒光 PCR實驗、LacZ報告基因融合實驗以及凝膠阻滯

13、實驗等方法探究 RovM和RovA對鼠疫菌生物被膜形成以及毒力相關(guān)的靶基因和調(diào)控子基因調(diào)控的分子機制。結(jié)果表明，RovM通過激活 hmsHFRS、hmsT、hmsCDE的表達，并同時抑制 hmsP的表達促進鼠疫菌生物被膜的形成。然而， RovM間接地抑制YPO1635-phoPQ-YPO1632的表達，卻不影響waaAE-coaD、phoPQ-YPO1632和fur的表達。RovA通過抑制hmsT、waaAE-coaD、YPO1635-

14、phoPQ-YPO1632和phoPQ-YPO1632的表達阻礙鼠疫菌生物被膜的形成。然而， RovA卻不影響hmsHFRS、hmsCDE、hmsP、fur和rovM的表達。并且，RovM通過直接抑制rovA的表達，且同時間接抑制psaABC和psaEF的表達來抑制鼠疫菌毒力。同時，RovM可以激活自身的表達，且在26℃下高表達而37℃下低表達。我們匯總本研究中的實驗結(jié)果以及前期的研究成果，大膽的提出了RovM和RovA在鼠疫菌致病和傳

15、播中可能存在的調(diào)控通路。在跳蚤體內(nèi)環(huán)境溫度（26℃）下，RovM處于激活狀態(tài)，它可以通過調(diào)控生物被膜形成相關(guān)決定性因子來促進鼠疫菌生物被膜的形成，并且同時抑制RovA的表達，使得RovA作用的大量毒力因子處于被抑制狀態(tài)，從而有利于增強鼠疫菌經(jīng)蚤傳播的能力。當鼠疫菌由跳蚤傳播到哺乳動物體內(nèi)后，其生存環(huán)境由26℃轉(zhuǎn)變?yōu)?7℃，此時RovM的表達明顯降低，導(dǎo)致生物被膜形成的相關(guān)決定性因子處于抑制狀態(tài)，而原本表達處于抑制狀態(tài)的RovA得到激活，