鼠疫耶爾森氏菌Pla蛋白的提取與純化.pdf

1、目的:建立從人工培養(yǎng)的鼠疫菌中提取纖溶酶原激活因子（Pla）的方法，以及建立純化Pla蛋白的方案，為今后制備單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。 方法:（1）用超聲破碎、鹽洗脫、尿素提取與硫酸銨鹽析相結(jié)合的方法嘗試Pla蛋白的提取。（2）進(jìn)行了磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）、Tris—HCl緩沖生理鹽水（TBS）兩種緩沖系統(tǒng)的各種pH對(duì)比，尋找Pla蛋白適宜的緩沖液來改善Pla蛋白可溶性。（3）用高效液相色譜分離純化Pla蛋白，優(yōu)化離子交換、凝膠

2、過濾，并將兩種層析組合。（4）用制備電泳法純化Pla蛋白，用距離測量的方式來定位Pla三條帶的位置。（5）用十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）對(duì)提取或純化的蛋白的組成進(jìn)行分析，結(jié)合Gel—pro Analyzer4.5凝膠圖像專業(yè)分析軟件計(jì)算蛋白分子量，并用纖溶平板檢測纖溶酶原激活劑活性。 結(jié)果:（1）鼠疫菌超聲破碎上清50—60%飽和硫酸銨沉淀和尿素的菌粉浸漬上清液（去除尿素）0—10%飽和硫酸銨沉淀獲得的

3、蛋白有分子量約31、35、37kDa的三條帶，并檢測到纖溶酶原激活劑的酶活性；鹽洗脫法獲得的飽和硫酸銨沉淀段均沒有檢測到酶活性。（2）在pH9.5的TBS中，Pla蛋白的溶解性最好。（3）用離子交換、凝膠過濾兩步層析純化的Pla蛋白主要由分子量約31、35、37kDa的三條蛋白帶組成，占到蛋白總量的80%以上，并檢測到酶活性。（4）用制備電泳法純化的Pla蛋白主要由分子量約31、35、37kDa的三條帶組成，條帶所在位置還有其它一些低濃