實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的研究.pdf

1、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是重要的人畜共患病微生物，能通過食物傳播。該菌能夠引起多種動物以及人的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌病。正因如此很多國家規(guī)定，對于進(jìn)出口的食品該菌是必檢的常規(guī)項(xiàng)目。常規(guī)的檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法操作步驟復(fù)雜，并且費(fèi)時，一般要3～7天，不能達(dá)到快速檢測食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的要求。所以建立一種快速、有效的檢測食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法是迫切需要的。
　　 Notomi T.等人在2000年研究開發(fā)出一種新

2、的核酸擴(kuò)增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）。本研究中所用的實(shí)時熒光LAMP技術(shù)可以通過與電腦連接，直接觀察反應(yīng)的進(jìn)行情況，不需要經(jīng)過繁瑣的凝膠電泳觀察結(jié)果。
　　 本研究選擇的靶基因是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail基因，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并選擇了一對特異性引物，利用實(shí)時熒光監(jiān)測儀62℃保溫反應(yīng)60min對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌進(jìn)行檢測。最終確定

3、的實(shí)時熒光LAMP反應(yīng)體系為:反應(yīng)內(nèi)引物FIP和BIP各3μmol/L，反應(yīng)內(nèi)引物F3和B3各0.5μmol/L，其它反應(yīng)組分分別為:2.5μLdNTPs，0.5 mM MgSO4，2μL10×Bst酶緩沖液，1μLBstDNA大分子聚合酶，1μL模板DNA，甜菜堿1 mmol/L，熒光染料0.5μL，純水補(bǔ)足體積到25μL。
　　 本研究以小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和其他非小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌作為試驗(yàn)用菌株進(jìn)行實(shí)時熒光LAMP的檢測

4、，通過對引物特異性進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果均為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌株，而其他的非小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌株結(jié)果均顯示為陰性，由此說明試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物特異性良好。從人工污染的雞肉中，采用3種方法進(jìn)行DNA模板的提取，并對其進(jìn)行比較，結(jié)果表明模板的提取方法對反應(yīng)的影響并不大，即實(shí)時熒光LAMP對模板的制備方法要求并不高。本研究還對反應(yīng)的靈敏度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度可以達(dá)到61CFU/mL，與PCR的方法比