小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica0)快速檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種人畜共患病病原菌，主要寄生于健康豬的因喉部位，可以通過食品等途徑傳染給人，導(dǎo)致食物中毒，對(duì)人類造成很大的威脅。
　　 本論文先通過普通PCR方法的建立確定特異性較高的引物，再通過對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌液的選擇確定樣品中本菌的增菌方法，最后再利用內(nèi)部擴(kuò)增質(zhì)控技術(shù)通過一系列試驗(yàn)建立小腸結(jié)腸炎耶爾森菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系，為鮮肉中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌快速檢測(cè)提供有效的技術(shù)手段和方法。本文分三部分進(jìn)行研究闡述

2、。
　　 1.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌普通PCR反應(yīng)的建立
　　 本試驗(yàn)根據(jù)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的ail基因進(jìn)行三對(duì)普通PCR反應(yīng)引物的選擇、特異性、靈敏性，以及反應(yīng)的退火溫度試驗(yàn)。同時(shí)將毒力基因ail與16s rDNA組合進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)。最后通過實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明aill引物特異性較高，靈敏性好，是本菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增的適宜引物。
　　 2.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇
　　

3、 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌作為一種食源性致病菌逐漸引起了關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)利用胰蛋白胨培養(yǎng)基、改良磷酸鹽緩沖液和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養(yǎng)基分別對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌，并采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)增菌效果進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明：在純菌體系中胰蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增菌作用優(yōu)于其他兩種培養(yǎng)基，并且增菌24h后即可檢測(cè)到該菌。在混菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)過改良磷酸鹽緩沖液增菌后靈敏性最高，并且增菌時(shí)間可縮短至8h。因此在實(shí)際檢測(cè)中可采用

4、改良磷酸鹽緩沖液對(duì)本菌進(jìn)行增菌檢測(cè)。
　　 3.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立
　　 本試驗(yàn)利用小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因ail作為目的基因進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，并且以大米的gos基因作為內(nèi)部擴(kuò)增質(zhì)控基因進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立。利用建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)從屠宰場(chǎng)取樣的32份下顎淋巴結(jié)和38份舌頭及扁桃體進(jìn)行檢測(cè).試驗(yàn)結(jié)果表明，單重和雙重實(shí)時(shí)熒光PCR

5、方法特異性均較高，檢測(cè)限分別為10pg/μL和100pg/μL。在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)傳統(tǒng)生化培養(yǎng)鑒定方法檢出率為5.71％，單重和雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢出率分別為44.29％和8.57％。雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法中各樣品的內(nèi)控基因均有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，這說明該反應(yīng)中無抑制PCR物質(zhì)存在。所有傳統(tǒng)方法檢出樣品均被實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢出，這說明本方法檢出時(shí)間快且檢出率高。
　　 綜上所述，本文選擇出一對(duì)特異性較高的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌引物，通