小腸結(jié)腸炎耶爾森菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶表達(dá)調(diào)控基因功能研究.pdf

1、目的:小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）是一種革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌，屬于腸桿菌科耶爾森菌屬，是耶爾森菌屬中的三大致病菌之一，可通過(guò)水和食品傳播以胃腸道癥狀為主的疾病。和其他腸桿菌科細(xì)菌一樣，Y.enterocolitica染色體攜帶ampR-ampC基因，表達(dá)產(chǎn)生AmpCβ-內(nèi)酰胺酶，從而對(duì)部分青霉素類和頭孢類抗生素產(chǎn)生天然耐藥。然而，盡管腸桿菌科細(xì)菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究較早，但目前尚沒(méi)有

2、報(bào)道Y.enterocolitica ampC表達(dá)調(diào)控機(jī)制的文獻(xiàn)。因此，本研究通過(guò)分子生物學(xué)、免疫學(xué)及微生物學(xué)技術(shù)對(duì)Y.enterocolitica AmpCβ-內(nèi)酰胺酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，旨在進(jìn)一步闡明該菌的耐藥機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)ampC上游的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用PCR方法擴(kuò)增預(yù)測(cè)序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物與原始質(zhì)粒pBBRLux連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUXampC。該質(zhì)?？筛鶕?jù)ampC基因的啟動(dòng)子強(qiáng)

3、弱而發(fā)出相應(yīng)的生物冷光，可用于指示細(xì)菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)量。
　　2.采用BLAST程序?qū)ふ铱赡艿腨.enterocolitica AmpD蛋白、低分子量青霉素結(jié)合蛋白(Low-Molecular-Mass Penicillin-Binding Proteins)以及β-N-乙酰葡萄糖胺酶(NagZ)編碼基因。通過(guò)無(wú)縫克隆技術(shù)將目的基因的上、下游同源臂(約1000bp)連接至自殺質(zhì)粒敲除載體pDS132，通過(guò)無(wú)痕敲除技術(shù)構(gòu)

4、建相關(guān)目的基因缺失株。
　　3.將ampC啟動(dòng)子活性檢測(cè)質(zhì)粒pLUXampC轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的ampD1、ampD2、ampD3、pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7、ampR以及nagZ缺失株中。常規(guī)培養(yǎng)后，檢測(cè)細(xì)菌的生物發(fā)光強(qiáng)度，以判斷各缺失株AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)量。
　　4.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌超生破碎，離心后取上清液，獲得細(xì)菌酶粗提物。分別使用頭孢硝噻吩和4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-

5、glucosaminide作為反應(yīng)底物，對(duì)待測(cè)菌株粗提物種的β-內(nèi)酰胺酶活性和β-N-乙酰葡萄糖胺酶(NagZ)活性進(jìn)行測(cè)定。
　　5.采用微量肉湯稀釋法測(cè)定各缺失株的抗生素最低抑制濃度(MIC)。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建基于生物發(fā)光技術(shù)的ampC啟動(dòng)子活性檢測(cè)質(zhì)粒，并命名為pLUXampC。
　　2.根據(jù)蛋白質(zhì)序列的同源性分析得知Y.enterocolitica105.5R(r)中WP_005156822

6、、WP_005164953和WP_013649890這三個(gè)蛋白均具有與AmpD相同的蛋白功能結(jié)構(gòu)域，將其命名為AmpD1、AmpD2和AmpD3，并構(gòu)建了七種與之相關(guān)的單、雙、三基因缺失株。AmpD1、AmpD2和AmpD3均為有功能的AmpD同系物蛋白，同時(shí)參與ampC的表達(dá)調(diào)控。AmpD蛋白缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性的增高，三基因缺失株YE△D123則出現(xiàn)了完全去阻遏持續(xù)高產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的表型特點(diǎn)。
　　3.構(gòu)建了

7、15種與低分子量青霉素結(jié)合蛋白(LMM PBPs) PBP4、PBP5a、PBP5b和PBP7相關(guān)的單、雙、三、四基因缺失株。發(fā)現(xiàn)以PBP5b為首的LMMPBPs對(duì)細(xì)菌ampC調(diào)控起關(guān)鍵作用。各缺失株的ampC啟動(dòng)子活性出現(xiàn)不同程度的升高，四基因缺失株YE△4△5a△5b△7出現(xiàn)了與YE△D123相似的持續(xù)高產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶表型。
　　4.為比較上述兩AmpC過(guò)表達(dá)菌株的區(qū)別，將YE△D123和YE△4△5a△5b△7的β-

8、N-乙酰葡萄糖胺酶基因(nagZ)敲除，發(fā)現(xiàn)該基因的敲除對(duì)于YE△D123無(wú)影響，而對(duì)YE△4△5a△5b△7的影響較大，nagZ基因缺失株YE△4△5a△5b△7△Z的β-內(nèi)酰胺酶活性降低至野生株相同水平。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUXampC建立了基于生物發(fā)光技術(shù)的細(xì)菌ampC表達(dá)水平檢測(cè)方法。該方法可在不影響細(xì)菌活性的情況下對(duì)細(xì)菌的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶表達(dá)量進(jìn)行監(jiān)測(cè);
　　2.Y.enteroco

9、litica可通過(guò)三個(gè)AmpD同系物對(duì)細(xì)菌的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行調(diào)控。其中AmpD1功能較強(qiáng)，單缺失株YE△D1（ampD1缺失）的AmpC酶表達(dá)量即出現(xiàn)明顯的上升;而AmpD2和AmpD3功能相對(duì)較弱，其負(fù)調(diào)控功能只有在雙、三基因缺失株中才能體現(xiàn)，在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)多AmpD參與的ampC逐級(jí)調(diào)控機(jī)制;
　　3.Y.enterocolitica的四種低分子量青霉素結(jié)合蛋白(LMM PBPs)均參與細(xì)菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的