肺炎克雷伯菌β-內(nèi)酰胺酶基因型研究.pdf

1、目的:研究天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶及碳青霉烯酶的基因型。
　　 方法:收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2008-2009年臨床分離肺炎克雷伯菌814株,以CLSI推薦紙片確證試驗(yàn)檢測(cè)其產(chǎn)ESBLs情況,以頭孢西丁試驗(yàn)初篩產(chǎn)AmpC酶菌株,改良三維試驗(yàn)檢測(cè)AmpC酶,應(yīng)用改良Hodge試驗(yàn)、酶提取物三維試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行碳青霉烯酶篩選,提取質(zhì)粒。DNA

2、作模板,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA序列分析確定ESBLs、質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶及碳青霉烯酶的基因型。
　　 結(jié)果:對(duì)頭孢西丁耐藥64株肺炎克雷伯菌進(jìn)行ESBLs基因型檢測(cè),同時(shí)檢測(cè)CTX、SHV、TEM三種基因型,結(jié)果顯示三種基因型的檢出率分別是CTX型ESBLs基因,陽(yáng)性率為64.06％; SHV型β-內(nèi)酰胺酶基因,陽(yáng)性率為67.19％；TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因,陽(yáng)性率為59.38％;同時(shí)攜帶2種以上基因,陽(yáng)性率為68.

3、73％。隨機(jī)選取3株經(jīng)PCR檢測(cè)為CTX型、3株SHV型、1株TEM型擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析,結(jié)果顯示3株肺炎克雷伯菌CTX型擴(kuò)增產(chǎn)物均屬CTX-M3型,經(jīng)NCBI基因庫(kù)查詢和BLASTn比對(duì),與源自大腸埃希菌菌株(登錄號(hào):FJ668787)相似性最高,為99％同源；2株肺炎克雷伯菌SHV型擴(kuò)增產(chǎn)物可確定為SHV-11型,與源自肺炎克雷伯菌SHV-11(登錄號(hào):GU064390)相似性最高,為100％同源；1株肺炎克雷伯菌SHV

4、型擴(kuò)增產(chǎn)物可確定為SHV-1型,與源自肺炎克雷伯菌SHV-1(登錄號(hào):GQ407132)相似性最高,為99％同源；1株肺炎克雷伯菌TEM型擴(kuò)增產(chǎn)物可確定為T(mén)EM-1型,與源自大腸埃希菌菌株TEM-1(登錄號(hào):FJ668751)相似性最高,為100％同源。對(duì)上述64株肺炎克雷伯菌進(jìn)行改良三維試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)AmpC酶菌株,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)同時(shí)檢測(cè)blaonA blaACT blaFox三種基因型,隨機(jī)挑取部分陽(yáng)性菌株進(jìn)行DNA測(cè)序分析

5、檢測(cè)質(zhì)粒AmpC酶基因型別。結(jié)果顯示:改良三維試驗(yàn)檢出18株AmpC酶菌株,經(jīng)PCR擴(kuò)增18株菌均在405bp處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,隨機(jī)選取1株經(jīng)PCR檢測(cè)為DHA型AmpC酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI基因庫(kù)查詢和BLASTn比對(duì),發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的DHA擴(kuò)增產(chǎn)物與基因庫(kù)blaDHA-1同源性為100％(登錄號(hào):AY635140),DNA測(cè)序分析顯示擴(kuò)增出的基因?qū)儆贒HA-1型。應(yīng)用改良Hodge試驗(yàn)、EDTA協(xié)同

6、試驗(yàn)和酶提取物三維試驗(yàn)對(duì)814株肺炎克雷伯菌進(jìn)行碳青霉烯酶篩選。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)碳青霉烯酶基因,并對(duì)部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示在我院共收集到3株對(duì)美羅培南耐藥(紙片擴(kuò)散法)的肺炎克雷伯菌,PER同時(shí)檢測(cè)blaKPC blaIMP blaIVM blaSME四種基因型,結(jié)果顯示2株菌攜帶KPC型碳青霉烯酶基因,1株菌攜帶IMP型金屬β-內(nèi)酰胺酶基因。隨機(jī)挑取1株經(jīng)PCR檢測(cè)為KPC型碳青霉烯酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物

7、進(jìn)行DNA測(cè)序,序列分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的KPC擴(kuò)增產(chǎn)物與基因庫(kù)blaKPC-2同源性為99％(登錄號(hào):EF062508),DNA測(cè)序分析顯示擴(kuò)增出的基因?qū)儆贙PC-2型,同時(shí)對(duì)1株經(jīng)PCR檢測(cè)為IMP型碳青霉烯酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序,序列分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的IMP擴(kuò)增產(chǎn)物與基因庫(kù)blaIMP-4同源性為99％(登錄號(hào):EU368858),DNA測(cè)序分析顯示擴(kuò)增出的基因?qū)儆贗MP-4型。
　　 結(jié)論:肺炎克雷伯菌耐藥