AmpC β-內(nèi)酰胺酶向持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)變的研究.pdf

1、第一部分，
　　目的:了解ampD基因特異突變對陰溝腸桿菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶由非持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型的影響作用。
　　方法:通過細菌鑒定、藥敏試驗,改良頭孢西丁三維試驗和質(zhì)粒ampC基因的擴增,篩選染色質(zhì)介導的產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的陰溝腸桿菌,擴增其染色質(zhì)ampD基因、測序并比對,確定其有義突變位點。采用定點突變的方法對野生型陰溝腸桿菌ampD基因進行上述特異位點的突變,形成相應的定點突變菌株;然后再用野

2、生型ampD基因代替臨床原始菌株的ampD基因,形成回復突變菌株。最后用改良頭孢西丁三維試驗和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶活性測定實驗測定突變前后菌株和回復突變菌株產(chǎn)酶類型的改變。
　　結(jié)果:臨床收集的121株陰溝腸桿菌中,15株為染色質(zhì)介導的產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的菌株,共篩選出ampD基因的8個有義突變位點,形成7株定點突變菌株。其中EclMA(274位插入A)、EclMC(327位缺失C)和EclMF(27位插入G)由非持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)

3、變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型,而EclMB(371位插入T)、EclMD(515位缺失C)、EclME(324位C變?yōu)锳)、EclMG(兩點同時的突變238C→A302T→A)的產(chǎn)酶類型未發(fā)生變化。從氨基酸水平分析,產(chǎn)酶類型發(fā)生改變的菌株的氨基酸改變分別為:93-169位全部改變(170/110位終止)、109-132位全部改變(133位終止)、10-25位全部改變(26位終止);而產(chǎn)酶類型未發(fā)生改變的菌株氨基酸的變化為:124-169位全部改變(1

4、70位終止)、172-187位全部改變(187位未終止)、108位變?yōu)榻K止密碼、80R→S101M→K。
　　結(jié)論:陰溝腸桿菌ampD基因中的3個特異基因突變導致的氨基酸移碼突變可使AmpC酶由非持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型。ampD基因編碼的AmpD酰胺酶可分解包括N-乙酰胞壁酰酐三肽在內(nèi)的粘肽成分,而這種分解作用很可能依賴AmpD酰胺酶的一個假設的活性區(qū)域。從我們的研究結(jié)果顯示,該活性區(qū)域很可能起源于ampD基因的25位或以后(

5、即AmpD蛋白的第9個氨基酸或之后),而終止于ampD基因的321位或以前(即AmpD蛋白的第107個氨基酸或之前)。而在上述活性區(qū)域內(nèi)的單個點突變造成的單個氨基酸的突變有可能并不對整個AmpD酰胺酶活性區(qū)域產(chǎn)生影響。當然我們也不排除ampD基因突變對AmpCβ-內(nèi)酰胺酶存在其他的影響機制。上述假設有待進一步研究。
　　第二部分，
　　目的:從體內(nèi)研究的水平揭示誘導型向持續(xù)高產(chǎn)型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)變的耐藥菌的轉(zhuǎn)變率,并對

6、其間患者的基礎(chǔ)疾病情況和抗菌藥物應用情況加以分析,對產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶菌株的臨床控制和治療起到初步提示的作用。
　　方法:篩選攜帶產(chǎn)誘導型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌的患者作為研究對象,定期收集其感染標本,至其攜帶菌株的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)化為持續(xù)高產(chǎn)型,并對其菌種、基礎(chǔ)疾病和期間抗生素使用情況進行數(shù)據(jù)收集,使用統(tǒng)計分析軟件stata8.0進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:兩家醫(yī)院共收集成為研究對象的感染患者559人,收

7、集到實驗入主菌株714株,其中銅綠假單胞菌527株,摩根摩根菌26株,鮑曼不動桿菌41株,粘質(zhì)沙雷氏菌25株,陰溝腸桿菌60株,產(chǎn)氣腸桿菌35株。這些菌株中有33株的AmpC酶由誘導型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型,轉(zhuǎn)變率為4.6％,各種細菌的轉(zhuǎn)變率分別為銅綠假單胞菌3.4％、摩根摩根菌7.7％、鮑曼不動桿菌4.9％、粘質(zhì)沙雷氏菌0％、陰溝腸桿菌13.3％、產(chǎn)氣腸桿菌占8.6％。腦血管疾病患者的陽性轉(zhuǎn)變率與非腦血管疾病患者相比,具有統(tǒng)計學差異,優(yōu)勢比

8、OR=4.9。在基礎(chǔ)疾病等其他條件相同的情況下,頭孢菌素類藥物應用天數(shù)與轉(zhuǎn)變率呈負相關(guān),而碳青霉烯類藥物應用天數(shù)與轉(zhuǎn)變率呈正相關(guān),其他抗菌藥物應用天數(shù)與產(chǎn)酶類型陽性轉(zhuǎn)變率未見明顯的相關(guān)性,而應用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物還是非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物未對陽性率結(jié)果產(chǎn)生明顯差異。
　　結(jié)論:銅綠假單胞菌(73.8％)是引起院內(nèi)感染的最常見的產(chǎn)誘導型AmpC酶的細菌;陰溝腸桿菌(13.3％)產(chǎn)酶類型的陽性轉(zhuǎn)變率最高。參與診治腦梗塞或其后遺癥患者