腸桿菌科細菌中CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶和質粒AmpC酶的研究.pdf

1、質粒型超廣譜β-內酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBLs)和染色體頭孢菌素酶(AmpC)是腸桿菌科細菌對新的廣譜頭孢菌素、氨曲南等耐藥的重要原因。近年的研究顯示，AmpC酶可以與ESBLs同時存在于同一個質粒上，攜帶此質粒的菌株對除碳青霉烯類以外的所有β-內酰胺類耐藥，這樣的質粒若在菌株之間傳播，將會對臨床治療和院內感染控制造成極大的困難。對于ESBLs的具體型別，世界各地研究報告有所差異，而中

2、國臨床分離的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細菌主要產CTX-M型ESBLs對于質粒AmpC酶的型別，世界各地研究報告大致相同，主要為DHA-1型AmpC酶，其次為CMY-2型。為了解華山醫(yī)院2005年臨床分離大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs和質粒AmpC酶的基因型，我們進行了以下3個方面的研究。 第一部分一種簡單的同時鑒定和檢測產超廣譜β內酰胺酶細菌的方法 目前，在臨床微生物實驗室中，通常采用CLSI推薦的酶抑制劑增強試驗檢

3、測大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌中的ESBLs檢測ESBLs時，常選用頭孢噻肟和頭孢他啶兩種第三代頭孢菌素作為篩選ESBLs的底物。但據國內外文獻報道，在中國，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌所產的ESBLs大多數為CTX．型ESBLs,此酶對頭孢噻肟的水解能力特別強。 CHROMagar 是一種專用于鑒定尿道感染病原菌的產色瓊脂，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分別在上面產生粉紅色和濕潤鐵藍色菌落。其原理是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌在生

4、長代謝過程中產生酶與培養(yǎng)基中的顯色底物發(fā)生反應而變色。在本研究中，我們通過采用這種能特異性鑒定大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的CHROMagar產色瓊脂，并結合64μg/mL，的頭孢噻肟，建立一種能同時達到鑒定細菌并檢測鑒定菌產生ESBLs功能的簡易方法，供臨床微生物實驗室應用。建立的簡易方法并和CLSI推薦的ESBLs確認方法一酶抑制劑增強試驗進行比較。 結果顯示，采用CLSI推薦的酶抑制劑增強試驗確認檢測260株大腸埃希菌中，ES

5、BLs的檢出率為67.3％(175/260)，肺炎克雷伯菌中ESBLs的檢出率為69.7％ (200/287)。CHROMagar產色瓊脂結合64μg/mL頭孢噻肟對上述細菌中的ESBLs的檢出率分別為66.1％(172/260)和68.6％(197/287)。兩種方法產ESBLs菌株檢出符合率為99.6％，靈敏度為98.3％～98.5％，特異性為100％。含64μg/mL頭孢噻肟的CHROMagar產色瓊脂可以同時用于菌種鑒定

6、和產ESBLs菌株的檢測。 第二部分疑似產ESBLs但頭孢吡肟敏感的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細菌中ESBLs和質粒AmpC酶的研究 在運用CLSI推薦的酶抑制劑增強試驗檢測臨床分離的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細菌中產ESBLs菌株時，往往會遇到細菌對頭孢噻肟和/或頭孢他啶耐藥，但頭孢噻肟/克拉維酸和/或頭孢他啶/克拉維酸的抑菌圈直徑分別與上述單藥的抑菌圈直徑之差<5mm，無法判斷這些菌株產生ESBLs的屬性。推測上述細菌可能同

7、時產生ESBLs和AmpC酶。由于AmpC酶的活性不能被克拉維酸所抑制，其產生的耐藥表型覆蓋了ESBLs產生的耐藥表型。因此可導致ESBLs檢測出現假陰性結果。我們對2005年上海華山醫(yī)院臨床分離的20株疑似產ESBLs但頭孢吡肟敏感的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細菌進行了ESBLs和質粒AmpC酶的研究。 結果顯示，20株疑似產ESBLs但頭孢吡肟敏感的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細菌主要產生質粒介導的AmpC酶。7株克雷伯菌屬細菌有6株

8、產DHA-1型AmpC酶，13株大腸埃希菌中有10株產CMY-2型.AmpC酶。2株產DHA-1型AmpC酶的肺炎克雷伯菌中還分別伴隨產生SHV-62型和CTX-M-14型ESBL。編碼ESBLs和DHA或CMY型質粒AmpC酶的基因可隨同質粒的轉移接合轉移至敏感細胞中。PFGE結果顯示，6株肺炎克雷伯菌的譜型均不相同；而11株大腸埃希菌中有7株譜型完全一致，7株譜型完全一致的菌株中有5株來源于同一病房(6病房)，另外2株分別來自27病

9、房和門診病人。這7株細菌中除一株分離時間較早外(2005年3月)，其余6株在1個半月內分離到(2005年11月～2005年12月)，所有7株細菌均產生CMY-2型質粒介導的AmpC酶，提示存在克隆菌株爆發(fā)流行的可能。 第三部分一株同時產CTX-M-14型ESBL、DHA-1型質粒AmpC酶、qnrB-4和qnrS-1基因的肺炎克雷伯菌的研究 上述第二部分的研究中發(fā)現20株大腸埃希菌和克雷伯菌屬細菌的藥敏試驗結果顯示：有1

10、6株細菌同時對頭孢噻肟和喹諾酮類等抗菌藥物耐藥。因此我們采用PCR技術對上述菌株進行質粒介導喹諾酮類藥物耐藥基因qnr基因進行檢測，并同時采用質粒轉移接合試驗、Southern雜交、PCR 等分子生物學技術對CTX-M-14型ESBL、DHA-1型質粒AmpC酶和qnr 等耐藥基因進行了基因定位研究。 PCR檢測qnr 基因結果顯示，7株克雷伯菌屬細菌中有6株qnrB基因檢測陽性，其中一株肺炎克雷伯菌(菌種號為05-2250)同

11、時檢出qnrS基因。而13株大腸埃希菌中無一株檢出qnr 基因。 PCR檢測結果顯示05-2250肺炎克雷伯菌同時含有以下4種基因：qnrB、qnrS、CTX-M-14和DHA-1基因。質粒轉移接合試驗獲得含單qnrB基因接合子以及同時含qnrB和qnrS基因接合子；通過電轉化試驗獲得單含qnrS基因接合子。環(huán)丙沙星Etest結果顯示供體菌05-2250肺炎克雷伯菌、單含qnrB接合子、單含qnrS接合子、同時含qnrB和qnr

12、S接合子以及接合子E.coli J53的MIC分別為0.75μg/mL、0.094μg/mL、0.38μg/mL、0.25μg/mL、0.012μg/mL。接合子的環(huán)丙沙星MIC是受體菌E.coli J53環(huán)丙沙星MIC的8～32倍。質粒抽提結果顯示05-2250肺炎克雷伯菌共有4條質粒DNA條帶，質粒大小依次為180kb、40kb、6kb、4kb。以質粒DNA為模板，PCR檢測qnrB、qnrS、CTX-M-14和DHA-1基因結果顯