產超廣譜β內酰胺酶腸桿菌科細菌對磷霉素的耐藥機制研究.pdf

1、腸桿菌科細菌（Enterobacteriaceae）可引起多種社區(qū)及醫(yī)院獲得性感染，其中尿路感染(UTIs)是臨床常見感染性疾病，約有80％的非復雜性UTIs和40％的復雜性UTIs為大腸埃希菌等腸桿菌科細菌感染所致。近年來產超廣譜β內酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）腸桿菌科細菌發(fā)生率不斷升高，造成臨床可選用的有效抗菌藥物減少。
　　磷霉素是一種廣譜殺菌劑，對臨床常見革蘭陽性菌和陰性

2、菌均具有抗菌活性，與其他抗菌藥無交叉耐藥性，而與多種抗菌藥聯(lián)合應用時呈協(xié)同作用。磷霉素在國內常與萬古霉素聯(lián)合治療甲氧西林耐藥金葡菌(MRSA)等多重耐藥菌感染，不良反應低。在國際上，磷霉素用于治療非復雜性下尿路感染已有40年余，近年研究發(fā)現(xiàn)，應用磷霉素治療各類UTIs仍然高度有效，且細菌耐藥率低。2010年美國感染病學會(IDSA)和歐洲微生物學和感染病學會(ESCMID)推薦將磷霉素口服用于治療非復雜性UTIs，磷霉素靜脈制劑用于產E

3、SBLs腸桿菌科細菌感染。因為大腸埃希菌產ESBLs發(fā)生率高，選用藥物有限，國內也將磷霉素作為復雜性尿路感染的治療藥物。
　　1999年美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)制定磷霉素敏感性判定標準:MIC≤64μg/ml敏感，MIC=128μg/ml中介，MIC≥256μg/ml耐藥，僅推薦用于尿道分離大腸埃希菌。目前國內外針對非尿道分離大腸埃希

4、菌和其他腸桿菌科細菌的研究亦多應用此標準。2009年12月歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會(European Committee on Antimicrobial SusceptibilityTesting，EUCAST)推薦以MIC≤32μg/ml為磷霉素敏感性折點，適用于分離自所有部位的腸桿菌科細菌。
　　腸桿菌科細菌對磷霉素也存在耐藥現(xiàn)象，耐藥機制主要包括藥物攝取減少，靶酶位點改變和磷霉素修飾酶產生。
　　本課題根據CLSI

5、的ESBL確證試驗結果，收集了復旦大學附屬華山醫(yī)院2008年臨床分離的產ESBLs腸桿菌科細菌257株，包括144株大腸埃希菌和113株肺炎克雷伯菌。測定細菌對磷霉素及其他抗菌藥物敏感性;通過PCR擴增及序列測定，了解fos基因攜帶情況及周邊序列;對fos基因陰性的磷霉素耐藥菌株進行磷霉素轉運系統(tǒng)及靶酶相關的耐藥機制研究。從而了解產ESBLs細菌對磷霉素的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機制，明確fos耐藥基因的傳播機制，為多重耐藥菌的防控及抗菌治療提供

6、理論基礎。本研究包括以下三個部分:
　　第一部分產ESBLs腸桿菌科細菌對磷霉素及其他抗菌藥物的敏感性
　　方法與結果:用瓊脂稀釋法測定磷霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西丁、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、四環(huán)素、氯霉素18種抗菌藥物對產ESBLs腸桿菌科細菌的最低抑菌濃度(MinimalInhibitorty Con

7、centration，MIC)。測定磷霉素MIC時瓊脂中加入葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-pho sphate，G-6-P），濃度為25μg/m。磷霉素敏感性判斷標準采用2013版EUCAST藥敏判斷標準(MIC≤32μg/ml為敏感折點)。其他抗菌藥物根據2010年版CLSI藥敏判斷標準判定結果。統(tǒng)計大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對各種抗菌藥物的敏感率，比較對除磷霉素外的非β內酰胺類抗菌藥物不敏感菌株和敏感菌株分別對磷霉素的敏感率。

8、
　　76.4％(110/144)產ESBLs大腸埃希菌和77.9％(88/113)肺炎克雷伯菌對磷霉素敏感，兩者間無統(tǒng)計學差異(P=0.778)。如以MIC≤64μg/ml為磷霉素敏感性折點（CLSI尿路分離大腸埃希菌判定標準），產ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對磷霉素敏感率分別為82.6％和84.1％。
　　產ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松均耐藥，對哌拉西林敏感率≤5％，部分菌株對頭

9、孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南敏感，對亞胺培南、美羅培南敏感率＞96％，對頭孢西丁敏感率為59％～63％。大腸埃希菌對哌拉西林/他也唑巴坦敏感率為83.3％，肺炎克雷伯菌敏感率為46.9％。產ESBLs大腸埃希菌對阿米卡星敏感率為88.9％，而對慶大霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、四環(huán)素、氯霉素敏感率均低于50％。肺炎克雷伯菌除對四環(huán)素敏感率為61.0％外，對其他藥物敏感率亦低于50％。
　　阿米卡星不敏感大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌

10、對磷霉素敏感率分別為31.2％(5/16)和71.6％(48/67)。除阿米卡星、美羅培南和亞胺培南不敏感株外，其他抗菌藥物不敏感菌株對磷霉素敏感率均＞68％。
　　98.6％(142/144)大腸埃希菌和86.7％(98/113)肺炎克雷伯菌檢出CTX-M型ESBLs基因，CTX-M基因分型與磷霉素耐藥率無明顯關系（CTX-M-1組與CTX-M-9組比較，P值分別為0.882，0.664）。23.0％(26/113)肺炎克雷伯菌

11、檢出SHV型ESBLs或SHV合并CTX-M型ESBLs。
　　小結:磷霉素對產ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌具有良好抗菌活性，其他抗菌藥物耐藥株對磷霉素也有較高敏感性。
　　第二部分 fos基因相關的腸桿菌科細菌對磷霉素耐藥機制
　　背景:產生修飾酶是細菌對磷霉素的主要耐藥機制之一，通過對磷霉素分子結構的修飾使磷霉素失活，目前發(fā)現(xiàn)的磷霉素修飾酶主要有FosA、FosB、FosC、FosX及其各亞型。在磷霉素耐藥腸

12、桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)了fosA、fosA2、fosA3、fosC2基因。osA基因定位于質粒，最初發(fā)現(xiàn)于粘質沙雷菌中，后相繼在多種腸桿菌科、假單胞菌屬和不動桿菌屬細菌中被發(fā)現(xiàn)。希臘一項研究發(fā)現(xiàn)10％(3/30)磷霉素耐藥腸桿菌科細菌攜帶osA基因。2009年Wachino等學者在日本產CTX-M的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)兩種新型質粒介導磷霉素耐藥基因fosA3和fosC2。多項研究顯示1.0％-9.0％大腸埃希菌和1.1％肺炎克雷伯菌攜fosA3基

13、因。研究發(fā)現(xiàn)fosA3常與blaCTX-M(、)rmtB基因共同轉移。攜fosA3基因的質粒轉移很可能會加速磷霉素耐藥性播散，同時因其與ESBLs及其他耐藥基因之間的密切關系可能造成不同類別抗菌藥物耐藥性共同傳播。本部分研究通過PCR擴增，了解產ESBL腸桿菌科細菌特別是磷霉素耐藥菌株中fos基因攜帶情況;通fos基因周邊DNA序列測定，了解其周邊結構。
　　方法與結果:257株產ESBLs腸桿菌科細菌中行PCR檢測fosA，fo

14、sA2，fosA3，fosC2基因。對磷霉素不敏感菌株同時進fosB，fosB2，fosC，fosX基因檢測。結果發(fā)現(xiàn)，13.2％(19/144)產ESBLs大腸埃希菌和3.5％(4/113)產ESBLs肺炎克雷伯菌攜fosA3基因。fosA3基因陽性菌株均對磷霉素高度耐藥。fosA3基因在磷霉素耐藥菌中的檢出率分別為55.9％(19/34)和16％(4/25)，在高度耐藥菌株（MIC≥256μg/ml）中的檢出率分別為76.0％(19

15、/25)和28.6％(4/14)。有1株肺炎克雷伯菌K117檢出fosA基因，其磷霉素MIC為32μg/ml。未檢測到fosA2、fosC2、fosB、fosB2、fosC、fosX陽性菌株。
　　23株菌株中fosA3基因全長序列與最初報道的fosA3核苷酸同源性均為100％。1株肺炎克雷伯菌fosA基因(fosAK117)與在Tn2921中發(fā)現(xiàn)的fosA(fosATn2921)有95％同源性，氨基酸序列FosAK117與Fos

16、ATn292197.9％同源。對其中1株大腸埃希菌fosA3和肺炎克雷伯菌的fosA進行TA克隆，fos A3和fosA基因克隆株均對磷霉素高度耐藥(MIC分別為1024μg/ml及≥1024μg/ml)。
　　以大腸埃希菌C600或J53為受體菌，對所有磷霉素耐藥菌株進行質粒轉移接合試驗，并對接合子PCR檢測ESBLs基因、fos基因，ERIC PCR確證為接合子。23fosA3陽性菌中20株fosA3攜帶菌株成功接合，其中16

17、株細菌fosA3基因與CTX-M型ESBLs基因共同轉移，12株細菌中osA3與TEM-1廣譜β內酰胺酶基因共同轉移。fosA基因陽性肺炎克雷伯菌K117未能接合成功。
　　對5株fosA3接合子行引物步移法DNA測定分析fosA3基因周邊序列。5株細菌質粒fosA3上游均為插入序列IS26,與fosA35'端之間長度均為322bp。fosA3下游不完全相同:3株細菌質粒fosA3下游為IS26，與fosA33'端之間長度為536

18、bp或1758bp;2株細菌質粒fosA3下游為IS1294。對其中3株細菌行長序列測序、分析fosA3與ESBLs基因的位置關系，3株細菌質粒中blaCTX-M位于fosA3上游，其中2株細菌質粒同時攜帶4個耐藥基因:fosA3，blaCTX-M-9，blaTEM-1，rmtB。
　　1株磷霉素耐藥但os基因PCR檢測陰性的大腸埃希菌E265，磷霉素的耐藥性可通過接合試驗轉移至大腸埃希菌J53。提取接合子質粒進行酶切克隆、DNA

19、序列測定，發(fā)現(xiàn)一個新的fosA基因亞型(暫命名為fosA4)，介導大腸埃希菌E265對磷霉素的耐藥性。osA4與fosATn2921、fosA2、fosA3核苷酸序列有69％～73％的同源性。FosA4氨基酸序列與FosATn2921、FosA2、FosA3同源性為69％～80％，與FosB、FosC、FosX的同源性為14％～31％。
　　對fosA3基因陽性菌株進行MLST分型，發(fā)現(xiàn)菌株間的同源性低，19株fosA3陽性大腸埃

20、希菌屬于11個ST型，4株fosA3陽性肺炎克雷伯菌屬于3個ST型。
　　小結:fosA3為產ESBLs腸桿菌科細菌中最為流行的fos基因類型，并為本研究中大腸埃希菌對磷霉素高度耐藥的主要機制。fosA3基因常與ESBLs基因共同轉移。在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了新的質粒介導磷霉素耐藥基因亞型fosA4。IS26可能與fosA3轉移和傳播有關。
　　第三部分轉運系統(tǒng)及靶酶相關的腸桿菌科細菌對磷霉素的耐藥機制
　　背景:磷霉素靶

21、酶為二磷酸尿嘧啶-乙酰葡糖胺轉移酶(MurA)，磷霉素通過使其失活，干擾細菌細胞壁肽聚糖合成，從而發(fā)揮殺菌作用。MurA突變或超表達可導致細菌耐藥。
　　磷霉素通過甘油-3-磷酸轉運系統(tǒng)(GlpT)或磷酸己糖轉運系統(tǒng)(UhpT)轉運進入細胞。前者主要轉運甘油-3-磷酸(G-3-P);后者轉運G-6-P，并需G-6-P誘導打開。GlpT功能正常的菌株可在以G-3-P為唯一碳源的M9基本培養(yǎng)基（G-3-P-M9）上生長，GlpT功能障

22、礙的細菌則無法生長。同理，UhpT功能正常的細菌可在G-6-P為唯一碳源的基本培養(yǎng)基(G-6-P-M9)上生長，UhpT功能障礙者無法生長。編碼基因glpT和uhpT基因突變可直接導致相應轉運體功能障礙，進入細菌的磷霉素水平降低，從而導致細菌對磷霉素敏感性降低。uhpA編碼一種轉錄調節(jié)蛋白，可調控UhpT表達。pts基因和cyaA基因突變可導致胞內cAMP水平下降。低水平的cAMP可以下調GlpT和UhpT表達，介導耐藥。
　　方

23、法與結果:對15株fos基因陰性的磷霉素高度耐藥菌（包括大腸埃希菌5株，肺炎克雷伯菌10株）進行靶酶murA基因PCR擴增及序列測定。5株大腸埃希菌靶酶MurA氨基酸序列均無突變。1株肺炎克雷伯菌K672的MurA存在Gln7Pro氨基酸突變。4株肺炎克雷伯菌K2103，K2610，K190，K2304的murA基因擴增不成功，其他5株肺炎克雷伯菌靶酶MurA氨基酸序列無突變。
　　將15株fos基因陰性的磷霉素高度耐藥菌及標準菌

24、株ATCC25922接種到以甘油-3-磷酸(Glycerol3-phosphate, G-3-P)或G-6-P為單一碳源的M9基本培養(yǎng)基上。5株磷霉素耐藥大腸埃希菌和1株肺炎克雷伯菌無法在G-3-P-M9和G-6-P-M9上生長，提示這6株細菌同時存在兩種轉運體系統(tǒng)(GlpT和UhpT)功能障礙。9株fos基因陰性磷霉素耐藥肺炎克雷伯菌可在G-6-P-M9上生長，但在G-3-P-M9上未生長，提示這9株細菌UhpT轉運系統(tǒng)功能正常，而G

25、lpT系統(tǒng)存在功能障礙。
　　對15株耐藥菌和標準菌株轉運體相關基因glpT、 uhpT、 uhpA、pstI、 cyaA進行PCR擴增及序列測定。5株磷霉素耐藥大腸埃希菌glpT基因全序列均擴增失敗，內部保守序列引物擴增成功，推測這5株大腸埃希菌glpT邊緣序列可能存在大段缺失或突變。10株磷霉素耐藥肺炎克雷伯菌glpT基因全序列及保守序列均擴增失敗，推測10株肺炎克雷伯菌中glpT基因整個缺失或突變。glpT整個基因序列或大段

26、序列的缺失或突變可能直接導致GlpT轉運系統(tǒng)功能障礙。
　　無法在G-6-P-M9上生長的6株細菌（5株大腸埃希菌和1株肺炎克雷伯菌）UhpT氨基酸序列均無突變，提示UhpT功能障礙可能與UhpT轉錄或表達水平有關。其余9株細菌可在G-6-P-M9上生長，其中4株細菌UhpT序列無突變，3株細菌UhpT序列存在Ile127Val氨基酸突變，2株肺炎克雷伯菌UhpT全序列未能成功擴增。
　　除2株大腸埃希菌E2393和E296

27、7的UhpA序列測序失敗，1株肺炎克雷伯菌K672的UhpA全序列擴增失敗外，其他菌株UhpA氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)突變。5株大腸埃希菌中PstI和CyaA序列存在較多氨基酸位點突變。肺炎克雷伯菌中PstI和CyaA序列多擴增失敗或多次擴增濃度較低、測序失敗，僅2株肺炎克雷伯菌細菌PstI序列擴增成功，存在Va1229Ile，Asn241Ser突變。UhpA、PstI和CyaA是否可通過影響GlpT或UhpT表達介導耐藥尚需進一步研究。