2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌,也是全球非常重要的醫(yī)院感染病原菌,據(jù)統(tǒng)計,人類感染的非發(fā)酵菌中,60%為銅綠假單胞菌感染。近年來,銅綠假單胞菌感染的持續(xù)高發(fā),耐藥情況的日趨嚴(yán)峻,部分抗生素耐藥率的逐年上升,以及多重耐藥和泛耐藥的日益常見,均給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。有關(guān)銅綠假單胞菌耐藥機制的研究成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點,同時,因其耐藥機制極其復(fù)雜,也成為當(dāng)今研究的難點。
  超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)

2、是β-內(nèi)酰胺酶中的一種,是一類可水解氧亞胺基β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶,能導(dǎo)致對第三代頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和單環(huán)類抗生素如氨曲南,甚至第四代頭孢菌素如頭孢吡肟和頭孢匹羅的耐藥。ESBLs在銅綠假單胞菌中的檢出率越來越高,已經(jīng)成為銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺類抗生素臨床治療效果下降的最主要原因之一。但是,一直以來銅綠假單胞菌的ESBLs檢測存在爭議,尚無標(biāo)準(zhǔn)、高效的檢測方法,有關(guān)銅綠假單胞菌ESBLs攜帶情況、基因型別、

3、流行情況等等尚缺乏詳盡的數(shù)據(jù)。
  隨著分子生物學(xué)技術(shù)、信息技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)應(yīng)運而生。高通量測序技術(shù),又稱為下一代測序技術(shù),以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短為特點。高通量測序技術(shù)使人類獲取基因組信息的方式發(fā)生了重大的變革,尤其適用于基因組較小的微生物領(lǐng)域的研究,已成為微生物鑒定分型、毒力分析、傳播途徑、耐藥機制等方面研究的重要工具。
  本研究采用臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦的ESBL

4、s表型確證試驗,對本院可疑ESBLs陽性銅綠假單胞菌進行篩選,以多重 PCR方法對篩選陽性的結(jié)果進行耐藥基因的檢測,以了解我院銅綠假單胞菌ESBLs流行情況,并探討銅綠假單胞菌的ESBLs不同檢測方法間的優(yōu)劣;然后,通過高通量測序技術(shù)實現(xiàn)對其中一株多重耐藥菌株的全基因組測序,通過生物信息學(xué)分析,展開對銅綠假單胞菌的耐藥機制、耐藥基因環(huán)境等的研究。
  研究目的:
  了解廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌的耐藥性

5、及其超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的流行分布情況,深入分析銅綠假單胞菌的耐藥基因環(huán)境,探討其耐藥的分子機制。
  研究方法:
  1、收集2011年1月至2012年6月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室分離出的銅綠假單胞菌,所有菌株用VITEK2微生物全自動鑒定儀進行鑒定和藥敏實驗,篩選頭孢他啶耐藥(MIC≥16ug/ml)的銅綠假單胞菌株,即可疑產(chǎn)ESBLs菌株,并對患者特點、病區(qū)分布、標(biāo)本類型、藥敏結(jié)果等資料進行統(tǒng)計,分

6、析其流行病學(xué)特點。
  2、采用表型確證試驗篩選產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的菌株,并對表型試驗陽性菌株和表型試驗陰性菌株的耐藥率、多重耐藥、泛耐藥等情況進行統(tǒng)計學(xué)分析比較。
  3、采用多重 PCR技術(shù)對表型試驗陽性菌株進行相關(guān)耐藥基因檢測,了解本院銅綠假單胞菌 ESBLs的主要基因型別,并探討銅綠假單胞菌 ESBLs不同檢測方法的優(yōu)劣。
  4、用細(xì)菌 DNA純化試劑盒提取多重耐藥菌株 PA902的總 DNA,并用Illu

7、mina Miseq高通量測序儀進行測序。用Edena軟件進行數(shù)據(jù)拼接,RAST網(wǎng)上工具進行基因注釋,ResFinder和NCBI BLAST網(wǎng)上工具進行耐藥基因分析, NCBI BLAST網(wǎng)上工具進行耐藥基因遺傳環(huán)境分析,PlasmidFinder網(wǎng)上工具進行質(zhì)粒序列分析,MLST網(wǎng)上工具進行MLST分析。
  研究結(jié)果:
  1、111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌的流行病學(xué)分析和藥敏結(jié)果分析2011年1月至2012年6月

8、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室共分離出111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌。這些菌株分別來自于痰液63.9%(71/111)、胸水7.2%(8/111)、傷口分泌物7.2%(8/111)、尿液5.4%(6/111)、腹水4.5%(5/111)、血液3.6%(4/111)、其它標(biāo)本類型5.4%(6/111)。患者年齡分布為:≥80歲20.7%(23/111)、70-79歲26.1%(29/111)、60-69歲13.5%(15/111)、

9、50-59歲18.9%(21/111)、其它年齡20.7%(23/111)?;颊卟^(qū)分布為:重癥醫(yī)學(xué)科37.8%(42/111)、內(nèi)科綜合病區(qū)11.7%(13/111)、胸外科病區(qū)9.9%(11/111)、呼吸內(nèi)科病區(qū)9.9%(11/111)、其它外科病區(qū)15.3%(17/111)、其它內(nèi)科病區(qū)9.0%(10/111)、兒科0.9%(1/111)、外院5.4%(6/111)。111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌對11種抗生素的不敏感率如下

10、:哌拉西林94.4%、哌拉西林-他唑巴坦90.8%、頭孢吡肟81.1%、氨曲南91.9%、美羅培南72.7%、亞胺培南73%、慶大霉素55.9%、妥布霉素41.4%、阿米卡星31.5%、環(huán)丙沙星73%、左旋氧氟沙星66.7%。
  2、ESBLs表型確證試驗結(jié)果分析111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶表型確證試驗陽性菌株共23株,陽性率為20.7%;23株表型試驗陽性菌株的藥敏結(jié)果顯示除阿米卡星外,對其它10種抗

11、生素均呈現(xiàn)很高的耐藥率;經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計軟件的 X2檢驗,23株產(chǎn)酶株對頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星幾種藥物的耐藥率顯著高于88株非產(chǎn)酶株的耐藥率,對哌拉西林、氨曲南、美羅培蘭、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南耐藥率均較高,無統(tǒng)計學(xué)差異;產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株的多重耐藥、泛耐藥菌株比率經(jīng)X2檢驗,結(jié)果顯示產(chǎn)酶株的泛耐藥菌株和全耐藥菌株比率顯著高于非產(chǎn)酶株。
  3、多重PCR檢測ESBLs基因結(jié)果分析

12、用多重PCR對23株表型試驗陽性菌株進行檢測,發(fā)現(xiàn)20株ESBLs基因檢測陽性,其中19株為PER型,5株為TEM型,4株同時攜帶PER型和TEM型耐藥基因,未檢測出其它型別的ESBLs耐藥基因。
  4、選取了一株多重耐藥銅綠假單胞菌PA902,PCR法證實該菌株攜帶PER型ESBLs基因,對其進行高通量測序,共得到5,061,082條reads,預(yù)測基因組覆蓋深度為198倍。通過數(shù)據(jù)過濾和拼接,共獲得2693條contigs,

13、最長contig長為60,157 bp,N50為19,105 bp,平均contig長度為2915 bp,GC含量為62.5%。
  5、對拼接后的數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn),編碼β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因有3個,包括blaOXA-10, blaPER-1和blaVIM-2,氨基糖苷類耐藥基因發(fā)現(xiàn)了4個,分別為aph(3')-IId, aac(6')-Ib-cr, aacA4和aadA2,磺胺類耐藥基因有1個,為sul1,四環(huán)素耐藥基因有1個,為t

14、etG;氯霉素耐藥基因有1個,為floR。對染色體上的耐藥基因研究發(fā)現(xiàn),染色體攜帶突變的gyrA和parC基因,與喹諾酮耐藥密切相關(guān),另外還發(fā)現(xiàn)了多個與藥物外排相關(guān)的耐藥基因。
  6、對攜帶耐藥基因的 contigs進行研究,發(fā)現(xiàn) C401、C599、C651、C769和C1379等5個contigs攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因,并在這些contigs上面發(fā)現(xiàn)了1類和2類整合子的結(jié)構(gòu);對質(zhì)粒序列的研究發(fā)現(xiàn),基因組數(shù)據(jù)中存在一個可能與質(zhì)粒

15、復(fù)制相關(guān)的基因,11個與接合相關(guān)的基因,可能與多個耐藥基因的轉(zhuǎn)移有關(guān)。MLST研究發(fā)現(xiàn)該菌株屬于 ST389,為首次發(fā)現(xiàn)攜帶 blaVIM-2和blaPER-1的ST389銅綠假單胞菌。
  結(jié)論:
  1、我院頭孢他啶耐藥銅綠假單胞菌感染以引起中老年、危重患者的呼吸道感染為主,對頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌,對常用多種抗生素耐藥率高,多重耐藥和泛耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。
  2、表型確證實驗檢測我院頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌,產(chǎn)

16、ESBLs菌株檢出率為20.7%;產(chǎn)酶株和非產(chǎn)酶株對哌拉西林、氨曲南、美羅培蘭、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南耐藥率均較高,無統(tǒng)計學(xué)差異;產(chǎn)酶株對頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星的耐藥率顯著高于非產(chǎn)酶株,且產(chǎn)酶株的泛耐藥菌株和全耐藥菌株比率顯著高于非產(chǎn)酶株。
  3、我院2011年至2012年6月臨床分離的頭孢他啶耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs以PER型最常見。
  4、高通量測序可快速、全面、準(zhǔn)確

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