CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的分布、進(jìn)化及抗藥活性研究.pdf

1、背景與目的:
　　CTX-M-55型ESBL,最初于2005在泰國(guó)被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，與CTX-M-3型ESBL相比較，其有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，即在第77位的纈氨酸取代原來(lái)的丙氨酸，第240位的甘氨酸取代天冬氨酸。不同國(guó)家不同地域，CTX-M-55型ESBL的分布流行情況不同。同一國(guó)家的不同地區(qū)，CTX-M-55的分布流行情況也存在差異。目前，河南地區(qū)CTX-M-55型ESBL的流行分布情況尚不明確。
　　在本課題組前期進(jìn)行的 CT

2、X-M型分子進(jìn)化研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌中存在頭孢噻肟酶的一條進(jìn)化路徑，即 CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55。但由于編碼CTX-M型ESBL的耐藥基因可以在不同菌種間通過(guò)質(zhì)粒水平傳播，目前河南地區(qū)與CTX-M-55型ESBL相關(guān)酶型是否存在其他的進(jìn)化路徑及進(jìn)化節(jié)點(diǎn)，仍需要進(jìn)一步的分析研究。
　　本課題組通過(guò)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合子的抗藥活性來(lái)間接反映CTX-M型ESBL的抗藥活性。但是由于攜帶 blaCTX-M-

3、55耐藥基因的質(zhì)粒往往攜帶有其他耐藥基因，該種方法并不能客觀評(píng)價(jià)單一CTX-M-55型ESBL的抗藥活性。
　　為解決以上問(wèn)題，我們?cè)O(shè)計(jì)了該課題。旨在通過(guò)臨床標(biāo)本分離菌的統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)，探明河南地區(qū)CTX-M-55型ESBL的分布特征；通過(guò)構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，明確與CTX-M-55型ESBL相關(guān)的進(jìn)化路徑和進(jìn)化節(jié)點(diǎn)；通過(guò)構(gòu)建CTX-M-55轉(zhuǎn)化子，客觀評(píng)價(jià)CTX-M-55型ESBL抗藥活性，最終為臨床抗攜帶CTX-M-5

4、5型ESBL菌株感染治療提供實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)。
　　第一部分：CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的分布及進(jìn)化研究
　　方法:
　?。?）菌株收集及藥敏實(shí)驗(yàn)收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室2015年9月份至2016年6月份三代頭孢菌素耐藥的革蘭陰性桿菌300株。藥敏試驗(yàn)根據(jù)CLSI2015判斷結(jié)果
　?。?）ESBL表型確證實(shí)驗(yàn)按CLSI推薦方法進(jìn)行ESBL表型確證實(shí)驗(yàn)
　?。?）普通PCR初篩產(chǎn)bla

5、CTX-M-55-like菌株
　?。?）blaCTX-M-55-like耐藥基因的全長(zhǎng)序列擴(kuò)增及測(cè)序。
　?。?）ERIC1-PCR檢測(cè)菌株同源性
　?。?）普通PCR檢測(cè)其他ESBL編碼基因
　　（7）進(jìn)化分析采用 MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用 NETWORK軟件進(jìn)行進(jìn)化節(jié)點(diǎn)分析。
　　結(jié)果:
　　1. CTX-M型ESBL在革蘭陰性菌中的分布情況
　　23％的革蘭陰性菌為產(chǎn)CTX

6、-M型ESBL菌株,依次為CTX-M-3(42.1%)， CTX-M-15(33.4%), CTX-M-55(20.3%), CTX-M-64(n=1.4%), CTX-M-136(1.4%)和 CTX-M-187(1.4%)。
　　2.產(chǎn)CTX-M-55型ESBL菌株的臨床分布流行特征及耐藥表型
　　產(chǎn)CTX-M-55型ESBL菌株主要為大腸埃希菌，主要分布在外科科室,主要分離于血液標(biāo)本。藥敏結(jié)果顯示該類(lèi)菌株對(duì)頭孢噻肟與頭

7、孢他啶的耐藥率極高，均為92.86%。對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星有較好的敏感性。
　　3. CTX-M-55型ESBL在各菌種間的分布情況
　　CTX-M-55型 ESBL主要分布于大腸埃希菌(9/14)，肺炎克雷伯菌(3/14)，弗氏檸檬酸桿菌(1/14)和摩根摩根菌（1/14）。ERIC結(jié)果顯示各菌株均不同源。
　　4.河南地區(qū)blaCTX-M-55耐藥基因相關(guān)進(jìn)化路徑及進(jìn)化節(jié)點(diǎn)分析
　　在大腸埃希菌中存

8、在頭孢噻肟酶的新進(jìn)化節(jié)點(diǎn)即CTX-M-136。
　　第二部分 CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的抗藥活性研究
　　方法:
　　(1)構(gòu)建pUCm-T-CTX-M-55克隆載體
　　(2)構(gòu)建pET-30a(+)-CTX-M-55表達(dá)載體
　　(3) CTX-M-55型ESBL的誘導(dǎo)表達(dá)采用SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)CTX-M-55型ESBL融合蛋白表達(dá)情況。
　　(4) CTX-M-

9、55轉(zhuǎn)化子抗藥活性檢測(cè)采用 VetekⅡ全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)CTX-M-55轉(zhuǎn)化子活性，以2015年CLSI為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建pUCm-T-CTX-M-55克隆載體。
　　2.成功構(gòu)建pET-30a(+)-CTX-M-55表達(dá)載體。
　　3. CTX-M-55型ESBL融合蛋白主要為上清表達(dá)。
　　4.上清表達(dá)最佳誘導(dǎo)條件：IPTG0.5mM,溫度11℃，過(guò)夜誘導(dǎo)。

10、
　　5. CTX-M-55轉(zhuǎn)化子對(duì)青霉素、頭孢菌素一代、三代及四代中多數(shù)藥物耐藥，且對(duì)頭孢噻肟的水解活性強(qiáng)于頭孢他啶。對(duì)氨基糖胺類(lèi)、氟奎諾酮類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)、加酶抑制劑類(lèi)表現(xiàn)敏感。
　　結(jié)論:
　　1.河南地區(qū)大腸埃希菌是CTX-M-55型ESBL主要攜帶菌株。
　　2.河南地區(qū)首次檢出 CTX-M-136型 ESBL和 CTX-M-187型 ESBL,其中CTX-M-187型ESBL為世界首次報(bào)道。