C型凝集素受體在耶爾森氏菌致病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、第一部分宿主Langerin在鼠疫耶爾森氏菌致病機(jī)制中作用的研究
　　【背景與目的】
　　鼠疫耶爾森氏菌是鼠疫的致病菌，是一種革蘭氏陰性菌。鼠疫菌主要經(jīng)由跳蚤叮咬而傳播，它通過(guò)皮膚進(jìn)入宿主體內(nèi)后，快速傳播至淋巴結(jié)，造成淋巴結(jié)壞死或進(jìn)入血液向全身播散（敗血癥鼠疫），或造成肺部感染（肺鼠疫），引起的鼠疫病情發(fā)展快，死亡率高。但鼠疫菌在宿主體內(nèi)快速傳播至淋巴結(jié)的具體機(jī)制尚未研究清楚。
　　鼠疫菌克服宿主皮膚屏障后，遇到朗格漢

2、斯細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，這些細(xì)胞將鼠疫菌捕獲并運(yùn)送至淋巴結(jié)。朗格漢斯細(xì)胞是表皮中未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，特異性表達(dá)一種 C型凝集素受體——Langerin，已有研究表明 Langerin能與多種病原微生物表面的糖分子相結(jié)合。鼠疫菌是一種粗糙型菌株，即在其菌體外表面不表達(dá)O抗原，核心寡糖呈自然裸露狀態(tài)。我們前期的研究結(jié)果表明，某些粗糙型革蘭氏陰性菌的核心寡糖可以與C型凝集素受體結(jié)合。
　　在本研究中，我們觀察鼠疫菌與朗格漢斯細(xì)胞的相互作用

3、，探討 C型凝集素受體Langerin與核心寡糖的結(jié)合在鼠疫菌的侵襲和傳播中的作用。
　　【方法】
　　1.檢測(cè)粗糙型、光滑型和深度粗糙型鼠疫菌對(duì)人朗格漢斯細(xì)胞的侵襲
　?。?）用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)鼠疫菌 KIM10-（粗糙型，核心寡糖自然裸露）、KIM10--O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）以及KIM10--core-（深度粗糙型，核心寡糖缺失突變）對(duì)人朗格漢斯細(xì)胞的侵襲能力（此方法檢測(cè)的是侵入人朗格漢斯細(xì)胞且在

4、胞內(nèi)存活的鼠疫菌）。
　　（2）用CFDA-SE標(biāo)記這三種鼠疫菌，加至人朗格漢斯細(xì)胞中相互作用2 h，用臺(tái)盼藍(lán)淬滅細(xì)胞外熒光，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度（此方法檢測(cè)的是侵入人朗格漢斯細(xì)胞內(nèi)的所有鼠疫菌）。
　　2.檢測(cè)粗糙型、光滑型和深度粗糙型鼠疫菌對(duì)CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲
　　將Langerin基因和DEC-205基因分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)鼠疫菌KIM10-（粗糙型）、KIM10

5、--O+（光滑型）以及KIM10--core-（深度粗糙型）對(duì)CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲。同時(shí)檢測(cè)這三種細(xì)菌對(duì)CHO-NEO、CHO-DEC-205穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲，作為對(duì)CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞侵襲的對(duì)照。
　　3.檢測(cè)核心寡糖突變株對(duì)CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲
　　為了尋找在核心寡糖-Langerin結(jié)合中起關(guān)鍵作用的糖分子，我們用核心寡糖不同長(zhǎng)度缺失的大腸桿菌突變株（由于目前沒(méi)有鼠疫菌核心

6、寡糖的突變株），與 CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞相互作用，找到介導(dǎo)此作用的糖分子。
　　4.侵襲抑制實(shí)驗(yàn)
　?。?）檢測(cè)臍帶血來(lái)源的人朗格漢斯細(xì)胞（hcbLCs）和表皮來(lái)源的人朗格漢斯細(xì)胞（hLCs）表面Langerin和DC-SIGN表達(dá)水平，用抗Langerin（CD207）抗體或抗DC-SIGN（CD209）抗體與人朗格漢斯細(xì)胞作用20 min，再加入鼠疫菌KIM10-與之作用，用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)細(xì)菌的侵襲。

7、r>　　（2）將CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞與Langerin抗體、Langerin純化蛋白、不同的寡糖、單糖分別作用20 min，再加入鼠疫菌KIM10-與之作用，用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)細(xì)菌的侵襲。
　　5.檢測(cè)鼠疫菌與Langerin純化蛋白以及DC-SIGN樣分子的結(jié)合
　　分別用FITC標(biāo)記的Langerin純化蛋白以及DC-SIGN樣分子Mermaid與鼠疫菌KIM10-（粗糙型）或KIM10--O+（光滑型）相

8、互作用，洗去未結(jié)合的蛋白后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
　　6.體內(nèi)研究
　　（1）用鼠疫菌KIM6+（粗糙型，核心寡糖自然裸露）或KIM6+-O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）經(jīng)皮感染小鼠，24 h后處死小鼠，分離腹股溝淋巴結(jié)，比較這兩組鼠疫菌在體內(nèi)傳播的能力。
　?。?）用鼠疫菌弱毒株 Y. pestis1418（粗糙型，核心寡糖自然裸露）或 Y. pestis1418-O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）經(jīng)皮感

9、染小鼠，比較這兩組鼠疫菌對(duì)小鼠存活的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.核心寡糖介導(dǎo)鼠疫菌對(duì)人朗格漢斯細(xì)胞的侵襲
　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）對(duì)人朗格漢斯細(xì)胞的侵襲能力顯著高于KIM10--O+（光滑型）以及 KIM10--core-（深度粗糙型），此結(jié)果說(shuō)明核心寡糖介導(dǎo)鼠疫菌對(duì)人朗格漢斯細(xì)胞的侵襲。
　　2.核心寡糖與Langerin的結(jié)合介導(dǎo)鼠疫菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲
　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）對(duì)CHO

10、-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲能力顯著高于KIM10--O+（光滑型）以及 KIM10--core-（深度粗糙型）的侵襲能力，且顯著高于對(duì)CHO-NEO、CHO-DEC-205穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲能力。這些結(jié)果說(shuō)明，核心寡糖與Langerin的結(jié)合介導(dǎo)鼠疫菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲，Langerin是鼠疫菌的受體。
　　3.在核心寡糖-Langerin結(jié)合中起關(guān)鍵作用的糖分子
　　隨著核心寡糖長(zhǎng)度的縮短，大腸桿菌核心寡糖突變株侵襲CHO

11、-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的能力下降，說(shuō)明在核心寡糖-Langerin結(jié)合中起關(guān)鍵作用的糖分子位于核心寡糖的外核（outer core）中。
　　4. Langerin抗體、Langerin純化蛋白以及某些寡糖分子對(duì)鼠疫菌與人朗格漢斯細(xì)胞及CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的結(jié)合的抑制作用
　　加入Langerin抗體后，鼠疫菌KIM10-對(duì)人朗格漢斯細(xì)胞（hcbLCs和hLCs）的侵襲能力顯著下降。加入Langerin抗體、

12、Langerin純化蛋白以及某些寡糖分子后，鼠疫菌對(duì)CHO-Langerin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲能力也顯著下降。這些結(jié)果再次驗(yàn)證了Langerin是鼠疫菌的受體，核心寡糖是鼠疫菌表面的配體，核心寡糖與 Langerin的結(jié)合對(duì)鼠疫菌侵襲宿主細(xì)胞起重要作用。
　　5.鼠疫菌與Langerin純化蛋白以及Mermaid的結(jié)合
　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）與Langerin純化蛋白以及DC-SIGN樣分子Mermaid的結(jié)合能力顯著

13、高于KIM10-O+（光滑型），此結(jié)果再次證明Langerin是鼠疫菌的受體，且核心寡糖是Langerin的配體。
　　6.核心寡糖-Langerin相互作用對(duì)鼠疫菌在小鼠體內(nèi)的傳播及對(duì)小鼠存活的影響
　　在經(jīng)皮感染的小鼠模型中，鼠疫菌KIM6+-O+（光滑型）傳播至淋巴結(jié)的能力顯著低于KIM6+（粗糙型）；感染鼠疫菌Y. pestis1418-O+（光滑型）小鼠的存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于感染Y. pestis1418（粗糙型）的小

14、鼠。這些結(jié)果說(shuō)明核心寡糖-Langerin相互作用促進(jìn)鼠疫菌傳播至淋巴結(jié)的能力，影響小鼠的存活。
　　【結(jié)論】
　　本研究證實(shí) C型凝集素受體 Langerin是朗格漢斯細(xì)胞表面鼠疫菌的受體，Langeirn與鼠疫菌表面核心寡糖的結(jié)合介導(dǎo)鼠疫菌對(duì)朗格漢斯細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)鼠疫菌在體內(nèi)的傳播。
　　第二部分人DC-SIGN和小鼠SIGNR1在粗糙型假結(jié)核耶爾森氏菌致病機(jī)制中作用的研究
　　【背景與目的】
　　假

15、結(jié)核耶爾森氏菌是一種食源性革蘭氏陰性致病菌，在外界環(huán)境中廣泛分布，常常引起回腸炎和腸系膜淋巴結(jié)炎。假結(jié)核菌進(jìn)入消化道后，穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入淋巴結(jié)，引起淋巴結(jié)和回腸末端腫大，或播散至肝、脾等遠(yuǎn)處器官，但此過(guò)程的具體機(jī)制尚未研究清楚。
　　鼠疫菌是鼠疫的致病菌，具有極強(qiáng)的毒力，由假結(jié)核菌進(jìn)化而來(lái)。在進(jìn)化的過(guò)程中，鼠疫菌丟失了脂多糖結(jié)構(gòu)最外側(cè)的O抗原，因此核心寡糖自然暴露。假結(jié)核菌在26℃（外界環(huán)境溫度）條件下表達(dá)O抗原（稱為光滑型），而在

16、37℃培養(yǎng)條件下，它的O抗原的表達(dá)受到抑制，核心寡糖暴露出來(lái)（稱為粗糙型）。核心寡糖的自然暴露是鼠疫菌和假結(jié)核菌一個(gè)重要的差別，我們認(rèn)為它可能與細(xì)菌毒力的增加有關(guān)。
　　DC-SIGN是表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞表面的一種C型凝集素受體，能與多種病原微生物表面的糖分子結(jié)合。SIGNR1是小鼠表達(dá)的DC-SIGN的同源體之一。我們的前期研究表明，粗糙型大腸桿菌、淋病奈瑟氏菌等革蘭氏陰性菌的核心寡糖是 C型凝集素受體DC-SIGN的配體。

17、>　　在本研究中，我們探討假結(jié)核菌核心寡糖與DC-SIGN以及SIGNR1的相互作用，以及它對(duì)假結(jié)核菌在體內(nèi)傳播的影響。
　　【方法】
　　1.體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光滑型和粗糙型假結(jié)核菌對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞（hDCs）的侵襲能力
　?。?）用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)培養(yǎng)于26℃（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）或37℃（粗糙型，O抗原表達(dá)被抑制，核心寡糖暴露）下的假結(jié)核菌對(duì)hDCs的侵襲能力。此方法檢測(cè)的是侵入hDCs且在胞內(nèi)存活的假結(jié)核菌

18、。
　　（2）用CFDA-SE標(biāo)記這兩種假結(jié)核菌，加至hDCs中使其相互作用，用臺(tái)盼藍(lán)淬滅細(xì)胞外的熒光，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。此方法檢測(cè)的是侵入hDCs內(nèi)的所有假結(jié)核菌。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光滑型和粗糙型假結(jié)核菌對(duì)HeLa-NEO以及HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲能力
　　分別將 neo、DC-SIGN基因穩(wěn)轉(zhuǎn)到 HeLa細(xì)胞，用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)培養(yǎng)于26℃（光滑型）或37℃（粗糙型）下的假結(jié)核菌 Y1對(duì)HeLa-

19、NEO以及 HeLa-DC-SIGN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的侵襲能力。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光滑型和粗糙型假結(jié)核菌對(duì)hDCs、人肺泡巨噬細(xì)胞和HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲能力
　　用慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)光滑型假結(jié)核菌（26-PB1）以及粗糙型假結(jié)核菌（26-PB1?wb、37- PB1?wb和37-PB1）對(duì)人DCs、人肺泡巨噬細(xì)胞以及HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲能力。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光滑型和粗糙型假結(jié)核菌對(duì)小鼠腹腔

20、巨噬細(xì)胞以及 CHO-SIGNR1細(xì)胞的侵襲
　?。?）用慶大霉素保護(hù)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)光滑型假結(jié)核菌（26-Y1和26-PB1）以及粗糙型假結(jié)核菌（37-Y1和26-PB1?wb）對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲。
　?。?）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CHO-SIGNR1細(xì)胞 SIGNR1的表達(dá)，用慶大霉素保護(hù)法比較粗糙型假結(jié)核菌PB1?wb對(duì)CHO-NEO和CHO-SIGNR1細(xì)胞的侵襲。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光滑型和粗糙型假結(jié)核

21、菌對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲。
　　將光滑型假結(jié)核菌PB1和粗糙型PB1?wb注射至小鼠腹腔，作用1.5 h后，處死小鼠，收集腹腔巨噬細(xì)胞，用慶大霉素保護(hù)法比較兩組細(xì)菌對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較 O抗原表達(dá)受溫度調(diào)控的和持續(xù)性表達(dá) O抗原的假結(jié)核菌在小鼠體內(nèi)的傳播
　　（1）將O抗原表達(dá)受溫度調(diào)控的假結(jié)核菌（Y1-pBR322）和持續(xù)性表達(dá)O抗原的假結(jié)核菌（Y1-pAY100.1）灌胃至小鼠體內(nèi)，作

22、用3天之后，用平皿計(jì)數(shù)法、Real-time PCR法以及小動(dòng)物活體成像法比較兩組小鼠脾、肝、腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量；
　?。?）將帶有mCherry熒光標(biāo)記的假結(jié)核菌Y1 pBR322和Y1 pAY100.1注入小鼠結(jié)扎的小腸腸腔中，作用30 min后，取腸組織做冰凍切片，用免疫熒光法觀察細(xì)菌對(duì)腸壁細(xì)胞的侵襲。
　　【結(jié)果】
　　1.假結(jié)核菌核心寡糖的暴露增強(qiáng)其侵襲hDCs的能力
　　培養(yǎng)于37℃條件下的假結(jié)

23、核菌（37-Y1，粗糙型）對(duì)hDCs的侵襲能力顯著高于培養(yǎng)于26℃的假結(jié)核菌（26-Y1，光滑型）。此結(jié)果說(shuō)明，暴露核心寡糖增強(qiáng)了假結(jié)核菌侵襲hDCs的能力。
　　2. DC-SIGN是粗糙型假結(jié)核菌的受體
　　培養(yǎng)于37℃條件下的假結(jié)核菌（37-Y1，粗糙型）對(duì)HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲能力顯著高于對(duì)HeLa-NEO細(xì)胞的侵襲能力。此結(jié)果說(shuō)明，DC-SIGN是粗糙型假結(jié)核菌的受體。
　　3.核心寡糖與DC-S

24、IGN的結(jié)合介導(dǎo)粗糙型假結(jié)核菌對(duì)人DCs、人肺泡巨噬細(xì)胞以及HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲
　　粗糙型假結(jié)核菌（26-PB1?wb、37-PB1?wb、37-PB1）對(duì)人DCs、人肺泡巨噬細(xì)胞以及 HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲能力顯著高于光滑型假結(jié)核菌（26-PB1）。同時(shí)，粗糙型假結(jié)核菌（26-PB1?wb、37-PB1?wb、37-PB1）對(duì)HeLa-DC-SIGN細(xì)胞的侵襲能力顯著高于對(duì)HeLa-NEO細(xì)胞的侵襲能

25、力。這些結(jié)果說(shuō)明，核心寡糖與DC-SIGN的結(jié)合促進(jìn)粗糙型假結(jié)核菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲，再次證明了DC-SIGN是粗糙型假結(jié)核菌的受體。
　　4.核心寡糖與 SIGNR1的結(jié)合介導(dǎo)粗糙型假結(jié)核菌對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和CHO-SIGNR1細(xì)胞的侵襲
　　粗糙型假結(jié)核菌（37-Y1和PB1?wb）對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲顯著高于光滑型假結(jié)核菌（26-Y1和PB1）；粗糙型假結(jié)核菌（PB1?wb）對(duì)CHO-SIGNR1細(xì)胞的侵襲能力顯著

26、高于對(duì)CHO-NEO細(xì)胞的侵襲能力。這些結(jié)果說(shuō)明，核心寡糖與SIGNR1的結(jié)合介導(dǎo)粗糙型假結(jié)核菌對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲，再次證明了 SIGNR1是假結(jié)核菌核心寡糖的受體。
　　5.小鼠體內(nèi)核心寡糖與SIGNR1的結(jié)合介導(dǎo)粗糙型假結(jié)核菌對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲
　　粗糙型假結(jié)核菌在小鼠體內(nèi)對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲能力顯著高于光滑型假結(jié)核菌。此結(jié)果說(shuō)明，在小鼠體內(nèi)核心寡糖與 SIGNR1的結(jié)合介導(dǎo)粗糙型假結(jié)核菌對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的侵襲。<

27、br>　　6.光滑型假結(jié)核菌在小鼠體內(nèi)傳播的能力下降
　　持續(xù)性表達(dá)O抗原的假結(jié)核菌（光滑型）在小鼠體內(nèi)傳播至脾、肝、腸系膜淋巴結(jié)的能力顯著低于O抗原表達(dá)受溫度調(diào)控的假結(jié)核菌（在體內(nèi)O抗原表達(dá)受抑制，粗糙型）的侵襲能力，但它們對(duì)腸壁細(xì)胞的侵襲能力無(wú)明顯差別。此結(jié)果說(shuō)明，在假結(jié)核菌致病過(guò)程中的某些階段，核心寡糖的暴露對(duì)細(xì)菌的傳播具有重要意義。
　　【結(jié)論】
　　人DCs細(xì)胞表面的DC-SIGN和小鼠巨噬細(xì)胞表面的SIGN