K562細(xì)胞中Hsa-miR-196b功能的初步研究.pdf

1、白血病是造血組織的腫瘤疾病,其特征為白血病細(xì)胞在骨髓及其它造血組織中呈惡性、無限制地增生,浸潤全身各組織和臟器,使正常造血受抑制。在我國,白血病是常見的惡性腫瘤之一,死亡率大約為2.52/10萬。
　　 根據(jù)增生細(xì)胞類型,白血病可分為粒細(xì)胞性、淋巴細(xì)胞性和單核細(xì)胞性三類。按白血病細(xì)胞分化程度可分為急性及慢性兩大類。其中慢性粒細(xì)胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML),居我國慢性白血病發(fā)病率之

2、首。
　　 CML是一種發(fā)生在骨髓早期多能造血干細(xì)胞上的惡性增生性疾病(獲得性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病)。其主要特征為未成熟分化的早幼粒細(xì)胞在骨髓中呈惡性、無限制地增生,并在血液中大量累積。根據(jù)臨床進(jìn)展,CML的病程可分為慢性期(chronic phase,CP),加速期(accelerated phase,AP)和急變期(blastcrisis,BC)。該病進(jìn)展緩慢,但多數(shù)慢性期患者病情可逐步演變,可經(jīng)過加速期或直接進(jìn)入急變期

3、。一旦發(fā)生急性變,患者的存活期僅有3～6個月。
　　 CML的發(fā)生與費城染色體易位有著很深的聯(lián)系。費城染色體易位使9號染色體長臂(9q34)上的原癌基因ABL(c-ABL)移位至22號染色體(22q11)上的BCR(Break point cluster region)斷裂點上,重新組合成BCR-ABL基因。90％以上的CML中存在Ph染色體。融合基因編碼的融合蛋白P210,具有異常增強(qiáng)的酪氨酸激酶的活性,導(dǎo)致CML的發(fā)生。

4、r>　　 P210蛋白能與白細(xì)胞介素3受體β(interleukin-3 receptor beta)亞基相互作用,通過級聯(lián)放大的活化作用激活一系列控制細(xì)胞周期的蛋白質(zhì),從而加快細(xì)胞分裂。此外,P210蛋白還抑制DNA修復(fù),影響基因組的穩(wěn)定,使其更易產(chǎn)生遺傳突變。因此,P210蛋白所具有的增強(qiáng)型酪氨酸激酶活性被普遍認(rèn)為是引起CML的主要因為。
　　 microRNAs(miRNA)是一類真核生物中普遍存在的長度約為18～25個

5、核苷酸的單鏈RNA分子,通過與靶mRNA3’端非編碼區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。人類基因組編碼約一千余種miRNA,它們能夠靶向作用于哺乳動物基因組中至少30％的編碼基因。miRNA既可作為抑癌基因,下調(diào)原癌基因的活性；也可作為癌基因,下調(diào)抑癌基因的活性。不同的細(xì)胞類型中,同樣的miRNA可能作為癌基因或抑癌基因,而且在某類型的細(xì)胞中任何一個miRNA的靶基因一般不會只有一個,而每一個靶基因又可能和多個miRN

6、A相互作用,因組成了錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在轉(zhuǎn)錄后對各種基因進(jìn)行復(fù)雜的調(diào)控,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 本課研究通過生物信息學(xué)分析尋找能對BCR-ABL基因進(jìn)行靶向調(diào)控的miRNA分子,并進(jìn)行初步的實驗驗證。研究內(nèi)容主要有以下幾部分:
　　 第一部分:應(yīng)用TargetScan5.1生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測并得出可能與ABL的mRNA 3’UTR互補(bǔ)結(jié)合的miRNA。分析結(jié)果顯示Hsa-miR-196b可能通過與BCR-ABL

7、 mRNA 3’UTR部分結(jié)合而抑制其翻譯表達(dá)。結(jié)合檢索文獻(xiàn)的結(jié)果,選擇了Hsa-miR-196b,對其在CML中的功能進(jìn)行研究。
　　 第二部分:針對Hsa-miR-196b的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-Hsa-miR-196b(包括前體pre-Hsa-miR-196b及其3’、5’端各約200bp側(cè)翼序列)設(shè)計合成引物。從正常人外周血中提取基因組DNA作為模板,通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。通過Hpa Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切及T4連

8、接酶連接將其插入Lentilox 3.7(pLL-3.7)質(zhì)粒中。通過質(zhì)粒PCR及雙酶切篩選并鑒定出陽性重組質(zhì)粒,DNA測序鑒定其序列的保真性。
　　 實驗結(jié)果表明,成功克隆pri-Hsa-miR-196b,并將其正確地插入到pLL-3.7質(zhì)粒的克隆位點中,獲得pLL-3.7-196b表達(dá)載體。
　　 第三部分:將成功構(gòu)建的pLL-3.7-196b表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.91、包膜蛋白質(zhì)粒pCMV-VS

9、V-G共轉(zhuǎn)染至HEK293FT細(xì)胞中,以包裝能表達(dá)Hsa-miR-196b的缺陷性慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染72h后,收集含病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基,離心后過濾,獲得病毒上清。將病毒上清梯度稀釋后感染HEK293FT細(xì)胞,以表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)來計算病毒滴度。應(yīng)用SYBR Green Ⅰ實時定量PCR法檢測慢病毒載體感染后HEK293FT細(xì)胞中Hsa-miR-196b的表達(dá)情況,3％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的長度。
　　 病毒滴

10、度檢測結(jié)果為7.3±1.1×107TU/mL,具有較高的感染效率,可用于下一步的研究。實時定量PCR結(jié)果表明,與未感染的細(xì)胞相比,受慢病毒載體感染的HEK293FT細(xì)胞中Hsa-miR-196b的表達(dá)量提高了近22倍。溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增特異,擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度與預(yù)期的一致,說明該表達(dá)載體能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出成熟的Hsa-miR-196b。
　　 第四部分:以K562細(xì)胞為模型,用Hsa-miR-196b慢

11、病毒載體對其進(jìn)行感染,同時設(shè)陰性對照組與空白對照組。感染后12h,離心去上清,換入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染后96h裂解細(xì)胞,提取總RNA與總蛋白。利用實時定量PCR檢測Hsa-miR-196b的表達(dá)變化,western blot檢測P210蛋白表達(dá)變化,根據(jù)其結(jié)果評價Hsa-miR-196b過表達(dá)對P210蛋白表達(dá)的影響。
　　 實驗結(jié)果說明Hsa-miR-196b能抑制BCR-ABL基因的表達(dá),但不能說明這種抑制作用是由于直接的

12、靶向調(diào)控所導(dǎo)致的,還是由于Hsa-miR-196b靶向抑制調(diào)節(jié)了其它基因而影響到BCR-ABL基因的表達(dá)。因此,還需要更多、更深入的實驗來驗證和研究Hsa-miR-196b對BCR-ABL基因的調(diào)節(jié)作用。
　　 本課題運用生物信息學(xué)分析篩選出潛在的能對CML致病基因BCR-ABL進(jìn)行靶向調(diào)控的miRNA分子。運用PCR成功克隆其基因片段,構(gòu)建得到pLL-3.7-miR-196b重組表達(dá)載體。通過病毒包裝獲得能高效感染哺乳動物細(xì)胞