人參皂甙對K562細胞作用的基因表達譜研究.pdf

1、白血病是嚴重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，迄今白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用大，復發(fā)率高，而且對正常機體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。研究惡性腫瘤尤其是白血病細胞的誘導分化及逆轉(zhuǎn)機制已成為當今生物醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)最熱點的前沿課題之一。值得注意的是中藥以其調(diào)節(jié)陰陽平衡、注重整體、攻補兼施、毒副作用小、應(yīng)用范圍廣泛的優(yōu)勢性得到了廣泛認可和重視。從祖國醫(yī)學寶庫中尋找出既能促進正常造血，又能抑制白血病細胞惡性增殖，并誘

2、導其向成熟方向分化的天然誘導分化劑已成為治療白血病的希望和重要途徑。 人參(Panax Ginseng)作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的“補氣”要藥，已有數(shù)千年的臨床應(yīng)用歷史，傳統(tǒng)的中醫(yī)學認為人參具有大補元氣、補脾益肺、生津止渴、安神益智、補氣生血的作用。人參皂甙(Total saponins panax ginseng，TSPG)是人參的主要有效成分之一。近代研究證明，人參皂甙對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)都有影響，可以抑制細胞凋亡，抗感

3、染、擴血管、抗衰老、并對運動疲勞的恢復有一定作用。研究還發(fā)現(xiàn)，該類化合物在癌癥的預防和治療方面具有較強的活性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)人參的抗腫瘤作用及機制較為廣泛：可影響和調(diào)節(jié)免疫功能，增強機體對疾病的抵抗能力，從而抑制腫瘤的生長；可誘導癌細胞凋亡、抑制腫瘤的生長或誘導癌細胞分化使其逆轉(zhuǎn)；可抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移及腫瘤細胞新生血管的形成；還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性、增強抗癌藥的藥效。人參皂甙在誘導腫瘤細胞凋亡方面表現(xiàn)為：在人肝癌SK-HEP-

4、1細胞中，人參皂甙作用于凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2非敏感途徑，活化caspase-3蛋白激酶，該酶促使細胞周期相關(guān)復合蛋白p21(WAF1/CIP1)裂解并伴有周期素A依賴蛋白激酶CDK2的活化，從而導致細胞發(fā)生凋亡。在誘導分化方面表現(xiàn)人參皂甙粗提物可以使體外培養(yǎng)的Morris肝癌細胞在形態(tài)和功能方面向正常肝細胞轉(zhuǎn)化。在抑制腫瘤新生血管形成等方面表現(xiàn)為：人參皂甙有抑制B16-BL6黑色素瘤細胞浸潤基底膜，抑制腫瘤細胞與纖維粘蛋白和層粘蛋白的

5、黏附及入侵作用，并且能抑制腫瘤周圍新生血管的形成。但人參皂甙抗腫瘤作用的具體機制尚未完全闡明。 因此，本研究從分子水平上，利用基因表達譜芯片研究人參皂甙對體外培養(yǎng)的人紅白血病K562細胞作用后基因表達的改變，通過對芯片探針熒光信號值的數(shù)據(jù)進行分析，找出人參皂甙作用前后細胞的差異表達基因，然后結(jié)合生物學軟件研究差異表達基因的不同類別和生物學通路中的具體作用，從而在基因水平上對人參皂甙抗腫瘤的具體作用機制進行研究，為后續(xù)的藥物臨床研

6、究與開發(fā)提供實驗依據(jù)。 實驗研究分兩部分： 第一部分：采用光鏡、流式細胞儀、細胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色、透射電鏡等方法，觀察人參皂甙作用后K562細胞的各種變化。將K562細胞分為兩組，對照組為常規(guī)培養(yǎng)細胞，處理組在常規(guī)培養(yǎng)的細胞中加入不同濃度的人參皂甙。采用MTT法檢測人參皂甙對K562細胞的增殖抑制作用，運用血紅蛋白聯(lián)苯胺染色的方法檢測人參皂甙對K562細胞的誘導分化作用，用流式細胞儀分別檢測兩組細胞的表面抗原CD15

7、與CD235ab的表達變化；并先后采用光鏡與透射電鏡觀察兩組細胞。 MTT比色法檢測發(fā)現(xiàn)K562細胞增殖抑制程度有隨著人參皂甙濃度的增加而增強的趨勢；細胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色檢測發(fā)現(xiàn)200μg/ml人參皂甙作用3天時細胞的血紅蛋白含量最高；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，200μg/ml的人參皂甙作用3天后，K562細胞表面分化抗原CD15與CD235ab表達量均升高，與對照組比較具有顯著性差異(P<0.01)，說明200μg/ml的人

8、參皂甙具有誘導K562細胞向紅系、粒系方向分化的作用。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組與處理組細胞均呈圓形或卵圓形，散在或成簇排列。對照組細胞數(shù)量較多，細胞直徑介于3-8μm之間；人參皂甙處理組細胞數(shù)量相對較少，細胞直徑介于2-6μm之間。透射電鏡結(jié)果顯示人參皂甙作用K562細胞后，核仁變小，且電子密度增大，核膜下異染色質(zhì)增多，胞漿中可見中等電子密度的膜被顆粒，其形態(tài)趨于成熟方向分化。 可見，人參皂甙能抑制K562細胞增殖，并誘導其向紅

9、系、粒系細胞分化，提示人參皂甙有可能成為既能促進正常造血，又能抑制白血病等腫瘤細胞增殖，并誘導其分化的天然藥物。 第二部分：運用基因芯片技術(shù)，檢測人參皂甙作用后K562細胞的基因表達譜變化。首先分別提取對照組和人參皂甙組K562細胞的總RNA，采用1％瓊脂糖凝膠電泳進行RNA樣品的質(zhì)量鑒定。采用Agilent低RNA熒光線性擴增試劑盒對樣品進行雙色熒光標記：總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以Cy3標記對照樣品，Cy5標記人參皂甙處理

10、組樣品，合成熒光標記的cRNA，并對標記的cRNA進行純化。純化后的樣品和Agilent Human 1A 60mer寡核苷酸基因芯片進行雜交，雜交完畢后依次用漂洗緩沖液洗滌。然后采用Agilent基因芯片掃描儀掃描，掃描后的數(shù)據(jù)采用Feature Extraction軟件進行數(shù)據(jù)采集及標準化處理。然后采用Panther數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行生物學功能分析。最后采用半定量RT-PCR對有進一步研究價值且表達改變顯著的基因ODZ1、FO

11、SL1、CCNE2和LATS1進行驗證。 在芯片22153個檢測點中，發(fā)現(xiàn)共同差異表達基因362個，其中20個基因表達上調(diào)，主要涉及細胞增殖與分化相關(guān)基因，信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因，細胞發(fā)育相關(guān)基因等。表達下調(diào)的有342個，主要有免疫防御相關(guān)基因，蛋白質(zhì)合成、代謝與修飾相關(guān)基因，細胞周期相關(guān)基因等。RT-PCR結(jié)果表明，人參皂甙處理后，F(xiàn)OSL1、E2F2和CCNE2表達下調(diào)，ODZ1表達上調(diào)，與芯片雜交結(jié)果一致。 人參皂甙作用

12、后K562細胞基因表達譜的變化為：促進分化的基因上調(diào)，促進增殖的基因下調(diào)，從而使K562細胞的增殖受到抑制并有利于K562細胞的分化。表明人參皂甙對K562細胞有一定的誘導分化和增殖抑制的作用。 綜上所述，本研究采用人參皂甙作用K562細胞，利用MTT法、光鏡、流式細胞儀、細胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色、透射電鏡等手段，觀察了K562細胞的變化。研究表明，人參皂甙可以抑制K562細胞的增殖，并誘導部分K562細胞的分化。研究進一步結(jié)合