柴胡皂甙d誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)譜研究.pdf

1、白血病是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的惡性疾病，也是我國(guó)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。迄今白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用大，復(fù)發(fā)率高，且對(duì)機(jī)體正常免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。中藥以其調(diào)節(jié)陰陽(yáng)平衡、注重整體、攻補(bǔ)兼施、毒副作用小、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)得到了醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可和重視，中藥及其有效成分的抗腫瘤機(jī)理研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，也將為人類(lèi)腫瘤的治療開(kāi)辟新的途徑。 柴胡皂甙d(Saikosaponins-d，SSd)

2、是從傳統(tǒng)中藥柴胡中分離、提取出來(lái)的一種具有糖皮質(zhì)激素樣甾類(lèi)環(huán)結(jié)構(gòu)的皂甙衍生物。研究表明，柴胡皂甙d具有抗炎、抗驚厥、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多效生物效應(yīng)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者把柴胡皂苷d應(yīng)用于腎病、肝纖維化、腫瘤等疾病的治療，并取得可喜成就，尤以柴胡皂甙d抗腫瘤作用的研究倍受矚目。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)柴胡皂甙d的抗腫瘤作用機(jī)理主要涉及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤

3、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞毒作用等，其抗腫瘤作用是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 為進(jìn)一步闡明柴胡皂甙d的抗腫瘤作用機(jī)制，探討其對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)錄水平的影響，我們采用寡核苷酸芯片技術(shù)從全基因組水平上研究了K562細(xì)胞基因的表達(dá)譜變化，從而在基因水平上對(duì)柴胡皂甙d抗腫瘤的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，為后續(xù)的藥物臨床研究與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究分為以下兩部分： 第一部分：柴胡皂甙d對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

4、。 將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，對(duì)照組為含0.1％DMSO的培養(yǎng)基，其余4組分別為含不同濃度SSd的培養(yǎng)基，五組細(xì)胞分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h和72h后，CCK-8比色法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-FITC-PI)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)(Hoechst33258染色)以及梯狀DNA電泳等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、SSd處理前后不同時(shí)間之間OD值有顯著差異(F=121.567，P<0.001)

5、。除8μg/ml濃度組不同時(shí)間點(diǎn)之間的OD值無(wú)顯著差異(F=1.796，P=0.169)外，其余各濃度組OD值均有顯著差異(P<0.001)，雅分別為35.454、46.282、42.201和18.014，且OD值隨時(shí)間呈顯著上升趨勢(shì)。隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，8μg/ml濃度組的OD值有先升高后下降的變化趨勢(shì)，以0h時(shí)較低，24h時(shí)最高，72h最低。 2、對(duì)照組OD值顯著高于其它各藥物濃度組(F=65.547，P<0.001)。從

6、各時(shí)間點(diǎn)看，不同濃度組之間OD值的比較均有顯著差異(P<0.032)，以8μg/ml濃度組OD值最低，對(duì)照組最高。 3、不同藥物濃度與不同時(shí)間點(diǎn)之間存在交互效應(yīng)(F=12.275，P<0.001)，表明隨著時(shí)間的變化，各組的OD值變化幅度不同，最大值在對(duì)照組72h，最小值在8μg/ml濃度組72h。 4、時(shí)間因素不同水平間的多重比較均有顯著性差異，均P<0.050。除1μg/ml和2μg/ml濃度水平間無(wú)顯著差異外(P=

7、0.854)，其余濃度因素不同水平間的兩兩比較都有顯著性差異(P<0.050)。 5、8μg/mlSSd作用K562細(xì)胞48h后，部分細(xì)胞染色質(zhì)濃縮聚集，細(xì)胞核在光鏡下呈濃染致密的顆粒塊狀熒光，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)。DNA凝膠電泳出現(xiàn)典型的凋亡“梯狀”條帶。隨著SSd濃度的增高(1-8μg/ml)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率也逐漸上升，分別為13.01％、18.29％、35.58％和43.41％，而對(duì)照組凋亡率為0.33％。

8、 以上結(jié)果表明SSd能有效抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，抑制效應(yīng)呈明顯的時(shí)間.劑量依賴(lài)關(guān)系。 第二部分：應(yīng)用AgilentHuman1A寡核苷酸芯片系統(tǒng)研究SSd誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)譜變化。 8μg/mlSSd作用48h后，分別提取對(duì)照組和處理組K562細(xì)胞的總RNA，利用AgilentRNA熒光線性擴(kuò)增試劑盒合成熒光標(biāo)記的cRNA，SSd處理組用Cy5標(biāo)記，對(duì)照組用Cy3進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記好的cRNA

9、樣品經(jīng)純化后與寡核苷酸芯片雜交，Agilent2565BA基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描，AgilentFeatureExtraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù)軟件給出的LogRatioPValue確定表達(dá)差異的基因，結(jié)合PANTt-IER數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)將這些基因按照生物學(xué)功能進(jìn)行歸類(lèi)，并通過(guò)查閱GenBanK數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)部分差異顯著基因進(jìn)行深入的分析和討論。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在檢測(cè)的18716個(gè)基因和EST中，共篩出差異表

10、達(dá)基因359個(gè)，其中138個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，221個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)基因主要包括以下幾類(lèi)：①與mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)；②與細(xì)胞黏附有關(guān)；③與G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)；④與氧化磷酸化相關(guān)；⑤與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)：⑥與細(xì)胞凋亡相關(guān)；⑦與免疫防御機(jī)制相關(guān)；⑧與細(xì)胞周期相關(guān)等。通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因PEG10、EMP2；凋亡相關(guān)基因CASP3、CASP8；mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因CLOCK以及原癌基因TACC3等差異表達(dá)基因的功能及其

11、在代謝通路中的具體作用進(jìn)行了詳細(xì)的分析后，我們認(rèn)為SSd誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)主要是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制K562細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而晝夜節(jié)律基因的高表達(dá)及癌基因的表達(dá)下調(diào)說(shuō)明SSd能提高機(jī)體抵御腫瘤、防止腫瘤進(jìn)一步惡化發(fā)展的能力，同時(shí)還可能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)SSd作用的敏感性。 本研究首先采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)、Hoechst33258細(xì)胞核染色、流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-PI)以及DNA