RAS基因在K562細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、本研究的基本目標(biāo)為利用RNAi方法研究N-RAS基因在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用。實(shí)驗(yàn)研究分為三個(gè)部分：首先以從人類紅白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為模型，以正常人外周血白細(xì)胞為對(duì)照，研究K562細(xì)胞株中N-RAS基因的表達(dá)情況，為RNA干擾實(shí)驗(yàn)的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，在K562細(xì)胞中進(jìn)行N-RAS基因干擾實(shí)驗(yàn)，并分別在mRNA及細(xì)胞水平觀察N-RAS基因表達(dá)缺失的細(xì)胞表型；在研究N-RAS基因功能的同時(shí)，進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)條件

2、優(yōu)化的探索，具體研究mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNA干擾效果的影響，為提高RNA干擾效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究主要針對(duì)以下方面開展研究： 1.對(duì)N-RAS基因在K562細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。針對(duì)N-RAS基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)PCR特異性引物。擴(kuò)增特異性片段，純化PCR產(chǎn)物，連接T載體并轉(zhuǎn)化；提取重組質(zhì)粒，雙向測(cè)序鑒定，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLAST分析軟件，與NCBI所提供N-RAS基因序列進(jìn)行比對(duì)，

3、檢測(cè)突變位點(diǎn)；以正常人外周血白細(xì)胞為對(duì)照，看家基因GAPDH為內(nèi)參照，用RT-PCR方法對(duì)N-RAS基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。 2.進(jìn)行siRNA的篩選與干擾的初步研究。特異性siRNA可在不同程度抑制目的基因的表達(dá)，而靶基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是引起這種程度差異的原因之一，因此在進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)中，siRNA的設(shè)計(jì)應(yīng)將二級(jí)結(jié)構(gòu)的因素考慮在內(nèi)。根據(jù)測(cè)定序列設(shè)計(jì)siRNA。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)生抑制效應(yīng)后，利用RNAstructure3.5軟

4、件對(duì)N-RAS基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并分別針對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)與非二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，利用網(wǎng)絡(luò)在線工具設(shè)計(jì)共4對(duì)siRNA，分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48及72h后，分別采用RT-PCR、MTT及流式細(xì)胞檢測(cè)等方法在mRNA及細(xì)胞水平檢測(cè)干擾效果差異。對(duì)不同時(shí)間和不同靶序列的干擾效果進(jìn)行橫向及縱向比較，以探討時(shí)間及靶序列對(duì)干擾效果的影響。 上述研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，K562細(xì)胞中N-RAS基因無(wú)突變，其表達(dá)水平較正常細(xì)胞高。因而可推斷，

5、在K562細(xì)胞中進(jìn)行N-RAS基因的RNAi實(shí)驗(yàn)可行性高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于檢測(cè)。siRNA導(dǎo)入后，可引起mRNA表達(dá)水平的降低以及細(xì)胞不同程度的凋亡。誘導(dǎo)凋亡的效果在72h的干擾效果大于48h，針對(duì)非二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)靶序列的siRNA干擾效果優(yōu)于針對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)的siRNA。抑制N-RAS基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，證實(shí)N-RAS基因在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用。 綜上所述，本研究對(duì)白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞中的N-RAS