家蠅幼蟲抗菌肽對腫瘤細胞K562作用機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1．從三齡家蠅幼蟲體內分離純化，篩選具有抗腫瘤細胞K562（人慢性髓性白血病細胞）的抗菌肽，并鑒定其是否對人正常細胞293T 有抑制作用。
　　 2.觀察分離純化得到的抗菌肽對K562細胞存活率及生長曲線的影響，以及其對細胞膜通透性的影響，判斷其活性發(fā)揮的最佳質量濃度和作用時間，同時判斷抗菌肽對K562細胞膜的損傷程度，以及作用機制是否有直接殺傷作用；
　　 3．觀察分離純化得到的抗菌肽對K562細

2、胞細胞核和線粒體膜電位以及凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）的影響，從而探討抗菌肽殺傷K562的作用機制是否有誘導凋亡。
　　 方法：
　　 1．通過針刺感染大腸桿菌誘導家蠅三齡幼蟲大量表達抗菌肽，然后經過研磨、離心、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、反相高效液相色譜（reversed-phase high-performanceliquid chromatography,

3、RP-HPLC）分離純化家蠅三齡幼蟲抗菌肽，采用四甲基偶氮噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）比色法和光學顯微鏡觀察，篩選出對K562 有殺傷作用的抗菌肽。通過對比反相高效液相色譜儀在紫外波長214 nm和280nm時的色譜圖鑒定純化組分的蛋白質性。同時用MTT 法檢測篩選出的抗菌肽組分峰5～8對人正常細胞293T的作用。
　　 2.采用臺盼藍拒染計數法，記錄不同作用濃度和不同作用時間時K

4、562細胞的存活率及其相對抑制率，從而繪制生長曲線，觀察發(fā)揮活性的最佳質量作用濃度和作用時間；同時用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；
　　 3.小分子熒光素二乙酸熒光素FDA（Fluorescein Diacetate）標記，用熒光分光光度計檢測細胞膜熒光素的滲漏；用大分子熒光探針Dextran-FITC(40KD)標記，激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocAlmicroscope, LSCM）觀察對K

5、562細胞膜對大分子的通透性；
　　 4.用Hoechst33258 熒光標記，用熒光顯微鏡檢測家蠅三齡幼蟲峰5、峰8組分作用于K562細胞后，K562細胞核相對熒光強度的變化；以采用熒光探針羅丹明123 負載，用激光共聚焦顯微鏡觀察家蠅幼蟲抗菌肽對K562細胞線粒體膜電位的影響，以細胞內熒光強度表示線粒體膜電位大小。用caspase-3 檢測試劑盒和酶標儀測定caspase-3 酶的活性。
　　 結果：
　　

6、1.固相萃取得到10％、30％、80％的的乙腈水溶液組分與對照組比較，經方差分析具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中用Dunnett-t 法對各組分分別與對照組進行比較，三個組分與對照組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中sp8組分對K562細胞相對抑制率（inhibitionratio,IR）最高為84.98％。其中sp8組分經反相高效液相色譜純化，通過觀察波長為214 nm和280nm 條件下的色譜圖，并根據保留時間和分離度推斷

7、出：波長214 nm時出現的峰5～8分別與波長280nm時出現的峰c～f 相對應，同時，因為280nm是含芳香族氨基酸蛋白質的特質吸收峰，所以認為峰5～8組分就是抗菌肽。根據分離度判定標準，4個峰組分的分離度都在1.5 以上，滿足定量分析的要求，所以選擇這4個峰進行后續(xù)實驗。經Dunnett-t 法檢驗，峰5～8分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1-3），說明這4個峰（峰5～8）對K562細胞都有抑制作用。當質量濃

8、度為100μg/ml作用24 h，峰5和峰8 相對抑制率較高，分別為48.52％和65.80％。Sp8和峰5～8組分分別與對照組比較，經t 檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明抗菌肽sp8組分和峰5～8組分都對人正常細胞293T 無抑制作用。
　　 2.臺盼蘭拒染計數法檢測存活率和生長曲線發(fā)現：檢測到的不同質量濃度的sp8和峰5～ 8 處理K562細胞24 h后，各組分對K562細胞都有抑制作用，但是不成線性關系，25μ

9、g/ml基本沒有作用，50μg/ml時對K562細胞的作用較低，100μg/ml在細胞的抑制基本由不到半數到超過半數，以sp8、峰5、峰8組最為明顯。低質量濃度組(<25 μg/ml)與對照組（0μg/ml）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高質量濃度組分別與低質量濃度組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當質量濃度為50μg/ml和100μg/ml時，峰5、峰8分別和峰6、峰7組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.0

10、5）。Sp8和峰5、峰8作用組質量濃度為100μg/ml對K562細胞作用24小時后，在100倍光鏡下，對照組細胞形態(tài)完整；，對照組K562細胞視野凌亂，呈現出破碎程度不等的狀態(tài)，細胞發(fā)生變形，有的細胞形成缺口，內容物正在通過缺口向外釋放，即將發(fā)生細胞分解。Sp8、峰5～8 各組分當濃度為50μg/ml和100μg/ml時，隨著作用時間的增加， K562細胞的抑制率基本上呈逐漸升高，到24 h 左右達到一個高峰后開始逐漸降低，當在48

11、h時進行換液加藥后，抑制率再次呈逐漸升高繼而下降的趨勢；當濃度為200μg/ml時，隨著作用時間的增加, K562細胞的抑制率表現為持續(xù)上升，當48 h時進行換液處理后，抑制率明顯升高繼而持續(xù)上升。另外，對K562細胞的抑制率在48 h時處理前后均不成線性關系。
　　 3.不同濃度峰5和峰8處理K562細胞后，作用濃度低于50μg/ml的低濃度組相對熒光強度為（18.95±0.05）～（22.49±0.68），作用濃度50μg/

12、ml以上的高濃度組相對熒光強度為（62.77±4.08）～（70.81±0.18）。經單因素方差分析，高濃度各組（>50μg/ml）相對熒光強度分別與低濃度各組(<50μg/ml)進行兩兩比較LSD法，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。峰5、峰8作用2 h后，K562細胞膜對小分子熒光素FDA均有外泄。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到，細胞經100μg/mL的l峰5、峰8組分處理2 h，40KD的大分子熒光探針Dextran-FITC,個別

13、分布在細胞膜上，而經24小時處理后，熒光探針進入細胞，在細胞內形成亮點或亮塊，強度不一。這說明表明處理達到一定時間，細胞膜能通過40KD的大分子。4. Hoechst33258染色顯示：對照組的細胞核接近圓形，染色均勻而明亮，而 當質量濃度為100μg/ml的峰5和（或）峰8組分作用24 h后，有些細胞核破碎成塊狀,部分染色 呈彌散趨勢,說明家蠅三齡幼蟲抗菌肽可以引起K562細胞核損傷；部分細胞核的熒光強度增強，說明可以引起K562細胞

14、發(fā)生凋亡；用羅丹明123標記，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，對照組與抗菌肽峰5、峰8組的熒光強度經t檢驗具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組細胞內羅丹明123熒光強度很強，而抗菌肽組峰5、峰8作用組細胞內羅丹明123熒光強度很弱，說明家蠅三齡幼蟲抗菌肽可以使K562細胞線粒體膜電位降低；抗菌肽峰5、峰8組分作用組caspase-3的含量明顯高于對照組，兩組caspase-3含量經t 檢驗具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明家蠅三齡幼蟲抗菌

15、肽作用K562細胞后可以激活caspase-3，促進凋亡。
　　 結論：
　　 1.家蠅三齡幼蟲體內存在抑制K562細胞生長的抗菌肽和抗菌物質。本實驗得到峰5～8抗菌肽，其中峰5和峰8對K562細胞的抑制活性最強，對人正常細胞293T幾乎沒有作用，這與多數文獻的報道一致。
　　 2.家蠅三齡幼蟲抗菌肽對K562細胞膜的作用存在質量濃度閾值，低質量濃度時可引起膜通透性增加，高質量濃度時可引起細胞膜嚴重損傷。家蠅幼蟲