抗菌肽Anoplin和PFR對(duì)白血病細(xì)胞增殖的作用及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、抗菌肽是生物防御系統(tǒng)中產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)抗外源性病原體的肽類(lèi)物質(zhì)，是生物體內(nèi)固有的、非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。研究顯示抗菌肽具有明顯的殺傷革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的能力，其中少數(shù)的抗菌肽還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。Anoplin是2001年從獨(dú)居黃蜂毒液中分離得到的一種僅由10個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界存在的最短的具有線性α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽，其具有明顯的抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的作用，而對(duì)人類(lèi)的紅血球無(wú)溶

2、血作用。人類(lèi)的乳鐵蛋白是一類(lèi)分子量為80kDa的鐵離子結(jié)合型的糖蛋白，其N(xiāo)-末端包含一小段α-螺旋的11肽片段（LF11肽），該片段具有明顯的抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的活性。而“PFR肽”是根據(jù)人類(lèi)乳鐵蛋白LF11肽的構(gòu)效關(guān)系設(shè)計(jì)合成的一種僅含有9個(gè)氨基酸殘基的小分子抗菌肽?？紤]到白血病是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，因此，進(jìn)一步研究這兩種小分子抗菌肽對(duì)白血病細(xì)胞的影響具有重要意義。
　　 本研究以人慢性粒性白血病細(xì)胞株K5

3、62細(xì)胞，人急性粒性白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞和小鼠紅白血病細(xì)胞株MEL細(xì)胞為研究對(duì)象，以紫杉醇為陽(yáng)性對(duì)照藥物，采用MTT實(shí)驗(yàn)和顯微鏡觀察法檢測(cè)抗菌肽對(duì)白血病細(xì)胞增殖的抑制效果，采用PI染色結(jié)合倒置熒光顯微觀察法確定抗菌肽對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性的影響，采用掃描電鏡實(shí)驗(yàn)觀察抗菌肽對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜形態(tài)的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗茵肽對(duì)白血病細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響，采用Hoechst33342染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗菌肽是否引起白血病細(xì)

4、胞的凋亡。
　　 MTT實(shí)驗(yàn)和顯微觀察的結(jié)果顯示，抗菌肽Anoplin和PFR對(duì)小鼠正常骨髓細(xì)胞的增殖無(wú)影響，而這兩種抗菌肽以及紫杉醇均能劑量和時(shí)間依賴(lài)的抑制三種白血病細(xì)胞的增殖，且三種白血病細(xì)胞對(duì)Anoplin的敏感性順序?yàn)镸EL＞K562＞HL-60，三種白血病細(xì)胞對(duì)PFR的敏感性順序?yàn)镸EL＞HL-60＞K562。而對(duì)三種白血病細(xì)胞而言，抗菌肽PFR的抑制效果明顯優(yōu)于Anoplin的。PI染色結(jié)果顯示兩種抗菌肽處理后白血病

5、細(xì)胞膜的通透性均發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為對(duì)照組的白血病細(xì)胞未檢測(cè)到熒光，而抗菌肽處理后的白血病細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)了明顯的紅色熒光，且藥物劑量越大熒光越明顯。掃描電鏡結(jié)果顯示兩種抗菌肽處理三種白血病細(xì)胞后細(xì)胞膜均發(fā)生明顯變化，MEL細(xì)胞膜表面皺縮，破裂，甚至出現(xiàn)孔洞。HL-60細(xì)胞膜表面變得不平整，出現(xiàn)小孔。K562細(xì)胞膜表面破裂。以上結(jié)果均表明這兩種抗菌肽有可能首先是通過(guò)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)來(lái)起到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果的。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

6、的結(jié)果顯示兩種抗菌肽均能將MEL細(xì)胞的細(xì)胞周期顯著地阻滯在G0/G1期。Hoechst33342熒光染色結(jié)果顯示兩種抗菌肽處理后細(xì)胞核均出現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，但是并未發(fā)現(xiàn)典型的凋亡小體。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示兩種抗菌肽處理后并沒(méi)有出現(xiàn)典型的早期凋亡和晚期凋亡峰，與Hoechst33342熒光染色所得的結(jié)果一致。
　　 綜上所述，本研究的結(jié)果顯示了抗菌肽Anoplin和PFR不影響正常小鼠骨髓細(xì)胞的增殖，但能選擇性的抑制白血病細(xì)