模擬微重力對K562細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、研究背景:航天飛行導(dǎo)致人體多個(gè)系統(tǒng)發(fā)生改變,包括血液系統(tǒng)、心血管、前庭、骨骼、肌肉、免疫和內(nèi)分泌等一系列變化。隨著航天技術(shù)的發(fā)展,人們越來越關(guān)注航天帶來的這些變化及影響。其中血液學(xué)的改變早在很久以前就引起了航天醫(yī)學(xué)家們的重視。他們把這種表現(xiàn)為血漿容量減少,紅細(xì)胞數(shù)量下降,異形紅細(xì)胞增多的現(xiàn)象統(tǒng)稱為“航天貧血癥”。研究表明,“航天貧血癥”會(huì)隨著航天飛行時(shí)間的延長而加重,而且這種因適應(yīng)飛行而產(chǎn)生的改變,是否會(huì)成為不可逆轉(zhuǎn)的病理狀態(tài)?早期科學(xué)

2、家們只限于對血液學(xué)指標(biāo)的觀察,但僅僅是知道紅細(xì)胞數(shù)量的減少,異形紅細(xì)胞增多等這些是不夠的,為解決并預(yù)防航天過程中這些不利因素,為實(shí)現(xiàn)空間科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展和探索,近幾年來科學(xué)家們已經(jīng)開始著手對“航天貧血癥”的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究與探討。
　　 因航天試驗(yàn)研究花費(fèi)大,且實(shí)驗(yàn)條件不好控制,目前已有許多國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室開始使用微重力生物反應(yīng)器來模擬微重力環(huán)境進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。美國國家航空航天局(NASA)發(fā)明的旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary Ce

3、ll Culture System,RCCS)是一種重復(fù)性高、復(fù)雜的、三維的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。它的低剪切力、高的物質(zhì)傳遞效率和微重力的獨(dú)特環(huán)境,使我們在普通實(shí)驗(yàn)室的組織培養(yǎng)內(nèi)也能生長出三維細(xì)胞組織。目前它已成為公認(rèn)的模擬微重力環(huán)境的培養(yǎng)裝置。
　　 經(jīng)閱讀國內(nèi)外文獻(xiàn),許多研究顯示RCCS模擬的微重力環(huán)境能抑制造血細(xì)胞(如CD34+細(xì)胞、K562細(xì)胞)的增殖和分化。細(xì)胞增殖和分化是一個(gè)復(fù)雜的過程,受許多種因素的調(diào)控,是由各信號傳導(dǎo)通路

4、、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子以及癌基因等共同作用的結(jié)果。目前,對于微重力影響細(xì)胞增殖與分化的機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討和研究。K562細(xì)胞是一種人紅白血病細(xì)胞,因其在受到多種因素的誘導(dǎo)后具有向終末紅系、巨核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系分化的能力,常被作為研究細(xì)胞增殖與分化的一種模型。
　　 增殖是分化的前提。細(xì)胞的增殖與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的活化及有關(guān)基因的表達(dá)相關(guān),根據(jù)國內(nèi)外的研究,目前我們已經(jīng)了解與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號通路有細(xì)胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI

5、-3K/Akt)、成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白及轉(zhuǎn)錄因子E2F(pRb/E2F)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPKs)等。哺乳動(dòng)物的MAPKs分為三組,其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)在調(diào)節(jié)紅系增殖和分化中均具有重要作用。ERK通路促進(jìn)細(xì)胞增殖現(xiàn)已被廣泛地證實(shí),實(shí)驗(yàn)證明ERK1/2能調(diào)節(jié)c-myc、c-fos、p21CIP1、cyclinD1、cyclinD3等一系列細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。抑制ERK1/2活性能阻滯CD34+紅系祖細(xì)胞的增

6、殖,以及其紅系分化,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。
　　 紅細(xì)胞生成是一個(gè)復(fù)雜的生理過程,它是由多種基因尤其是紅系造血生長因子及轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控。氯化高鐵血紅素(hemin)即含鐵原卟啉Ⅸ,它是提供血紅蛋白攜氧能力的重要成分。hemin可作為紅系細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)紅系祖細(xì)胞、人紅白血病K562細(xì)胞血紅蛋白的合成。K562細(xì)胞就如同干/祖細(xì)胞,具有多向分化潛能,它的分化取決于一系列的特異性轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子變化消長態(tài)勢已經(jīng)確定了它分化的

7、方向。當(dāng)給予外部刺激(如hemin)時(shí),它的定向分化就開始“啟動(dòng)”。轉(zhuǎn)錄因子GATA-1,作為GATA家族中的一員,它在紅系分化和成熟過程中起著非常關(guān)鍵的作用。GATA-1基因的啟動(dòng)子有兩個(gè),分別為遠(yuǎn)端的紅系啟動(dòng)子和近端的睪丸啟動(dòng)子。在啟動(dòng)子上游存在GATA-1結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)成GATA-1基因的強(qiáng)啟動(dòng)子,這種強(qiáng)啟動(dòng)子是為充分活化及與體內(nèi)自身紅系核蛋白結(jié)合所必需。在原始細(xì)胞向紅系分化開始時(shí),GATA-1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子被激活后,總GATA-1表達(dá)

8、上調(diào),進(jìn)一步啟動(dòng)細(xì)胞向紅系的分化。
　　 我們的實(shí)驗(yàn)即采用RCCS-1模擬微重力培養(yǎng)K562細(xì)胞,觀察培養(yǎng)過程中K562細(xì)胞的變化,內(nèi)容分為兩個(gè)部分,第一部分觀察了K562細(xì)胞增殖情況,及與增殖有關(guān)的信號通路的變化；文章的第二部分我們還補(bǔ)充了微重力作用對K562細(xì)胞分化的影響:
　　 第一部分:模擬微重力對K562細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制
　　 目的:航天員在航天飛行條件下出現(xiàn)“航天貧血癥”,該部分實(shí)驗(yàn)建立在利用

9、RCCS-1模擬微重力環(huán)境,在地面培養(yǎng)K562細(xì)胞的基礎(chǔ)上,研究微重力環(huán)境對細(xì)胞增殖過程的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:采用美國國家航空航天局(NASA)旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary CellCulture System-1,RCCS-1)模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)人紅白血病K562細(xì)胞,研究其增殖情況。
　　 1)K562細(xì)胞的培養(yǎng)將K562細(xì)胞用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d細(xì)胞傳

10、代1次。取對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL；
　　 2)RCCS-1模擬微重力培養(yǎng)K562細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)使用RCCS-1(美國,Synthecon)模擬微重力。將傳代K562細(xì)胞置入50mL高截面縱橫比容器中,調(diào)整轉(zhuǎn)速至10～12 rpm,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
　　 3)細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 分別取RCCS-1和正常重力條件下培養(yǎng)的K562細(xì)胞,用牛巴氏計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)；
　　

11、 4)細(xì)胞周期檢測分別收集RCCS-1和正常重力條件培養(yǎng)同一時(shí)間點(diǎn)的K562細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；
　　 5)Western bloting檢測ERK1/2的表達(dá)取不同時(shí)間點(diǎn)RCCS-1培養(yǎng)的K562細(xì)胞,用磷酸化蛋白提取試劑盒提取蛋白后,用Western bloting方法檢測細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)表達(dá)及其磷酸化水平。
　　 結(jié)果
　　 1)模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)的K562細(xì)胞的增

12、殖速度顯著低于地面對照組(24h:t=0.480,P=0.020；48h:t=0.026,P=0.001)；同時(shí)還顯著抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,使其停滯在G0/G1期(t=0.001,P=0.001)；
　　 2)模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)的K562細(xì)胞ERK1/2的磷酸化水平隨時(shí)間逐漸下降(F=53.111,P=0.002)。
　　 結(jié)論:模擬微重力環(huán)境抑制K562細(xì)胞的增殖,使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,這可能是由模擬微重力作用下E

13、RK1/2磷酸化水平下降所導(dǎo)致。
　　 第二部分模擬微重力對K562細(xì)胞分化的影響
　　 目的:航天飛行會(huì)引起“航天貧血癥”,其核心是紅細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量下降,該部分實(shí)驗(yàn)仍是建立在RCCS模擬微重力環(huán)境,在地面培養(yǎng)K562細(xì)胞的基礎(chǔ)上,觀察微重力環(huán)境對細(xì)胞紅系分化的影響。
　　 方法:采用RCCS-1模擬微重力環(huán)境,培養(yǎng)K562細(xì)胞,并利用hemin誘導(dǎo)其向紅系分化。
　　 1)K562細(xì)胞培養(yǎng)及RCCS-1

14、培養(yǎng)同前,加hemin刺激分化；
　　 2)聯(lián)苯胺染色分別取各時(shí)間點(diǎn)模擬微重力和正常重力條件下培養(yǎng)的K562細(xì)胞,進(jìn)行聯(lián)苯胺染色,計(jì)數(shù)聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞率；
　　 3)Western bloting檢測GATA-1的表達(dá)分別回收模擬微重力和正常重力條件下培養(yǎng)的K562細(xì)胞,提取蛋白后,用Western bloting方法檢測GATA-1表達(dá)水平。
　　 結(jié)果
　　 1)hemin能誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化,

15、相同條件下培養(yǎng),hemin刺激時(shí)間越長,向紅系分化越多(Normal:F=387.997,P=0.000；RCCS:F=64.068,P=0.000);同一時(shí)間,微重力作用使hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞紅系分化較正常重力顯著減少(48h:t=0.000,P=0.006；72h:t=0.710,P=0.002)；
　　 2)通過Western bloting檢測發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間延長,兩組的GATA-1表達(dá)均增加(Normal:F=3

16、5.408,P=0.002；RCCS:F=59.002,P=0.000)；且RCCS-1模擬微重力組中,hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞GATA-1的表達(dá)與正常重力組無明顯差異(6h:t=1.832,P=0.416；12h:t=0.005,P=0.234；24h:t=6.578,P=0.053)。
　　 結(jié)論:模擬微重力環(huán)境抑制hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化,紅細(xì)胞生成減少,證實(shí)在微重力環(huán)境下“航天貧血癥”的發(fā)生。微重力未影響GA