模擬微重力對(duì)EPO誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向紅系分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 隨著航空航天事業(yè)的發(fā)展，人類向空間領(lǐng)域的開發(fā)和競(jìng)爭(zhēng)越來越激烈，2003年，“神州”五號(hào)載人飛船發(fā)射成功，揭開了中國載人航天工程的新篇章，2008年，“神州”七號(hào)成功發(fā)射，我國宇航員實(shí)現(xiàn)了首次太空出倉活動(dòng)。在航空事業(yè)繁榮進(jìn)步的同時(shí)，人們也開始越來越關(guān)注空間飛行對(duì)航天員的影響，人類在太空飛行后出現(xiàn)紅細(xì)胞數(shù)量下降是研究空間血液學(xué)的核心問題。早期的航天醫(yī)學(xué)家們對(duì)1960-1990年美國和前蘇聯(lián)的宇航員研究發(fā)現(xiàn)，其血液系

2、統(tǒng)的改變主要表現(xiàn)為血紅蛋白總量、紅細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞體積下降和網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量升高，他們稱之為“航天飛行性貧血”(spaceflight anemia)，并且這種血液學(xué)改變可以隨著飛行時(shí)間的延長(zhǎng)而變得更加明顯。這不僅不利于航天員們完成航天飛行任務(wù)更對(duì)其血液系統(tǒng)造成了潛在的的危害。于是“航天飛行性貧血”出現(xiàn)的原因和防止措施成為當(dāng)前空間血液學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　 模擬微重力與紅系分化:
　　 有研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力可以抑制UT-7

3、/EPO細(xì)胞的增殖，可能是通過激活caspases-3和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)而引起細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的，在我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力可以通過影響ERK1/2蛋白的磷酸化，使細(xì)胞停滯在G0/G1期，從而引起增殖障礙。在模擬微重力下UT-7/EPO細(xì)胞表面EPOR的表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力可以通過抑制臍血分選的CD34+細(xì)胞內(nèi)GATA-1的mRNA的表達(dá)影響其向紅系的分化。在RCCS中培養(yǎng)的骨髓CD3

4、4+細(xì)胞在2-3天時(shí)遷徙能力下降，主要表現(xiàn)為對(duì)SDF-1a的趨化反應(yīng)下降，與SDF-1a趨化作用相關(guān)的細(xì)胞骨架也發(fā)生了變化，其中細(xì)胞骨架中的F-actin的表達(dá)下降，同時(shí)淋巴細(xì)胞和成骨細(xì)胞的遷徙能力也受到抑制，并伴有細(xì)胞骨架的改變，這可能是外周血細(xì)胞減少的原因之一。綜上可見，模擬微重力可以通過多種途徑影響紅系的增殖與分化，導(dǎo)致出現(xiàn)“貧血”癥狀，其具體機(jī)制的研究是目前該領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問題。
　　 紅系分化是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，紅細(xì)

5、胞的生成是由造血干細(xì)胞分化為多向祖細(xì)胞，再不斷增殖逐步分化為紅系祖細(xì)胞、紅系前體細(xì)胞，最后發(fā)育成具有生理功能的成熟紅細(xì)胞。正常地面環(huán)境下，紅細(xì)胞的數(shù)量是由生成和凋亡維持著動(dòng)態(tài)平衡的，為保持紅系各階段增殖與分化，生長(zhǎng)與調(diào)亡之間的平衡，必須要有一個(gè)穩(wěn)定的造血微環(huán)境，這包括微血管系統(tǒng)，神經(jīng)、網(wǎng)狀細(xì)胞，基質(zhì)及基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子等，其中細(xì)胞因子在參與造血調(diào)控的過程中可分為正調(diào)控和負(fù)調(diào)控，前者包括干細(xì)胞因子(SCF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血

6、小板生成素(TPO)、集落刺激因子(GM-CSF、G-CSF)及大多數(shù)白細(xì)胞介素(IL)等，后者包括干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子（TNF）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等。而紅細(xì)胞的存活、增殖、分化、成熟主要由促紅細(xì)胞生成素(EPO)參與完成。
　　 促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一種重要的紅系干細(xì)胞造血因子，主要由腎臟產(chǎn)生，它在缺氧的情況下會(huì)大量生成，通過激活多條信號(hào)通路參與紅系分化為成熟紅細(xì)胞，通

7、過防止細(xì)胞凋亡促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖。當(dāng)EPO與EPO受體(Erythropoietin receptor，EPOR)相互作用后，可以使EPOR形成二聚體，隨后使JAK2酪氨酸激酶磷酸化，激活多條信號(hào)通路，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明，在缺失EPO和EPOR基因敲除的小鼠胎肝細(xì)胞內(nèi)，其紅細(xì)胞集落形成單位(CFU-E)和爆式紅系集落形成單位(BFU-E)與正常細(xì)胞數(shù)量相同，但卻不能進(jìn)一步分化為含有血紅蛋白的紅細(xì)胞，即成熟紅細(xì)胞，這說明EPO和E

8、POR可能在紅系祖細(xì)胞終末分化期中起促進(jìn)紅細(xì)胞分化和成熟的作用。
　　 EPOR屬于Ⅰ型單跨膜細(xì)胞因子受體超級(jí)家族成員，由507個(gè)氨基酸組成，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。當(dāng)EPO與EPOR作用后，激活的EPOR可以和另一個(gè)EPOR單體形成EPOR復(fù)合二聚體，并選擇性的和JAK2酪氨酸激酶結(jié)合，JAK2酪氨酸的Y1007被磷酸化而激活，從而伴隨著多種酪氨酸蛋白的磷酸化，包括JAK2本身，STAT蛋白、SHIP-1、SHC、Vav、

9、Gabl、Gab2, SYK, SHIP,IRS-2以及EPOR等，當(dāng)它們相繼磷酸化后，即可分別激活各自所在的信號(hào)通路，參與紅系增殖與分化。其中參與紅系分化中研究和報(bào)道較多的為PI3K/AKT信號(hào)通路。3-磷酸肌醇激酶(PI3K)是一種廣泛存在于人體大多數(shù)組織細(xì)胞的激酶，也存在于人紅白血病細(xì)胞K562細(xì)胞的細(xì)胞膜上。經(jīng)典的PI3K由p85調(diào)節(jié)亞基和p110催化亞基組成，可編碼至少7種適配蛋白或者調(diào)節(jié)蛋白。PI3K可通過其p85調(diào)節(jié)亞基的

10、SH2區(qū)與EPOR的Tyr479相結(jié)合，這種結(jié)合被認(rèn)為是調(diào)控紅系祖細(xì)胞增殖、分化和成熟的重要的信號(hào)通路的起始。激活的PI3K可產(chǎn)生兩種脂質(zhì)體（PI-3，4-P2和PI-3，4，5-P3），作為第二信使激活A(yù)KT。AKT是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又名蛋白激酶B，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有廣泛的表達(dá)。在K562細(xì)胞，AKT主要位于細(xì)胞質(zhì)中。AKT通過它的NH2結(jié)構(gòu)區(qū)域與磷酸化的PI3K脂質(zhì)體在細(xì)胞膜上相結(jié)合，之后AKT的蘇氨酸308可通過磷酸依賴

11、激酶1(PDK1)磷酸化而被激活，它的絲氨酸473則被EPO磷酸化，當(dāng)這兩個(gè)位點(diǎn)都被磷酸化后，AKT即被完全激活，激活的AKT通過核轉(zhuǎn)位從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)參與下一步的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，AKT介導(dǎo)的信號(hào)通路主要參與細(xì)胞存活、增殖與抗凋亡。研究表明，激活的PI3K/AKT通路可以進(jìn)一步激活紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1而參與紅系的增殖和分化。
　　 GATA-1是紅系祖細(xì)胞分化晚期表達(dá)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，它屬于鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族包括

12、多個(gè)成員，其中GATA-1、GATA-2和GATA-3為基礎(chǔ)造血因子。GATA-1主要表達(dá)于紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和肥大細(xì)胞系，它以三種方式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控:結(jié)合于啟動(dòng)子上參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體組成;結(jié)合于增強(qiáng)子上加強(qiáng)啟動(dòng)子活性;在紅系細(xì)胞中作用于珠蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，α、β珠蛋白基因座控制區(qū)等。GATA-1在紅系祖細(xì)胞早期階段可明顯促進(jìn)紅系增殖，而在紅系祖細(xì)胞晚期階段是其分化、發(fā)育和成熟不可或缺的重要因子。在紅系分化晚期，GATA-1的表達(dá)量也會(huì)

13、下降，這可能是由于在紅系分化早期階段GATA-1的表達(dá)量已經(jīng)足以維持最終生成成熟紅細(xì)胞的量了，其自身便不在產(chǎn)生，于是隨著紅系的不斷分化GATA-1也不斷被消耗，其表達(dá)量逐步下降。GATA-1可以促進(jìn)內(nèi)源性GATA-1、EKLF、β珠蛋白以及est-1基因等的表達(dá)，同時(shí)內(nèi)源性的EPOR表達(dá)也會(huì)升高。這些紅系基因表達(dá)的程度均與EPO信號(hào)通路相關(guān)，一組研究則發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT是GATA-1在EPO誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向紅系分化、成熟中的重要

14、通路，在EPO的作用下，GATA-1的S310殘基可以通過磷酸化而激活，激活后的GATA-1具有生物學(xué)功能，在幾乎所有的紅系表達(dá)基因編碼的珠蛋白調(diào)節(jié)區(qū)均可發(fā)現(xiàn)GATA-1結(jié)合的基因序列，并且，GATA-1還可通過調(diào)節(jié)Bcl-xL的表達(dá)量而發(fā)揮抗凋亡作用，以上均表明GATA-1在紅系增殖和分化中都扮演了重要的角色。
　　 研究目的:
　　 模擬微重力是否是通過影響EPOR受體形成、PI3K/AKT信號(hào)通路及其下游的GATA

15、-1等與紅系增殖、分化相關(guān)的因素的表達(dá)來影響EPO誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向紅系分化的呢？目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 研究方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)利用旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary Cell Culture System，RCCS4)模擬微重力，以K562細(xì)胞建立紅系分化模型，研究模擬微重力對(duì)K562細(xì)胞向紅系分化的影響及其機(jī)制，具體技術(shù)路線為:
　　 (1)我們首先用rhEPO誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，建立紅系分化模

16、型，用聯(lián)苯胺染色和流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞血紅蛋白表達(dá)情況及細(xì)胞表面EPOR和CD71的表達(dá)情況;
　　 (2)再用RT-PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)環(huán)境下K562細(xì)胞內(nèi)GATA-1、EPOR、β-globin的mRNA表達(dá)水平;
　　 (3)同時(shí)用western-blot方法檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)AKT、GATA-1的蛋白表達(dá)情況，初步探索模擬微重力影響K562細(xì)胞向紅系分化的機(jī)制。
　　 研究結(jié)果及結(jié)論: