T-2毒素影響K562細胞向紅系細胞分化相關(guān)的基因組和蛋白組研究.pdf

1、T-2毒素是由鐮刀菌等霉菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族A類毒素。T-2毒素廣泛存在于自然界，是一類常見的引起全球性谷物糧食污染性霉菌毒素之一。該毒素是單端孢霉烯族毒素中急性毒性最強的一種，嚴重危害人畜健康。動物食入這種霉變的糧食則會引起拒食、嘔吐、白細胞減少、造血系統(tǒng)萎縮及各種免疫抑制反應(yīng)，抑制蛋白質(zhì)合成，從而引起致癌性等毒性反應(yīng)。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，T-2毒素的主要靶器官之一是動物的造血系統(tǒng)，可引起動物骨髓和脾臟等造血器官損傷，使動物造血系統(tǒng)中多

2、能造血干細胞(CFUs)，粒系祖細胞(CFU-GM)，分化后紅系祖細胞(CFU-E)，分化前紅系祖細胞(BFU-E)等明顯減少，紅細胞和血小板計數(shù)下降，貧血等。然而，早期對單端孢霉烯族毒素對造血系統(tǒng)損傷的研究并不深入，T-2毒素影響造血干細胞分化的分子機制及信號通路研究還不清楚。鑒于T-2毒素造血系統(tǒng)毒性的重要性，我們選擇處于多能造血干細胞狀態(tài)的人紅白血病K562細胞為研究對象，利用目前比較先進的基因芯片技術(shù)和雙向凝膠電泳技術(shù)，通過分析

3、T-2毒素對造血干細胞分化毒性相關(guān)的差異基因組和差異蛋白質(zhì)組，探討T-2毒素影響造血干細胞分化為紅系細胞的分子機理，深入揭示T-2毒素血液系統(tǒng)毒性的機制，為其解毒提供理論依據(jù)。
　　 本研究采用MTT法檢測T-2毒素(5～50 nM)對K562細胞株分別作用24～72 h后細胞活力的影響，并檢測T-2毒素(5～50 nM)對K562細胞作用48 h后細胞LDH釋放率，發(fā)現(xiàn)T-2毒素能夠顯著抑制K562細胞活力，表現(xiàn)出顯著的時間、

4、劑量依賴性的毒性效應(yīng)。
　　 通過流式細胞術(shù)檢測特異性結(jié)合CD235a-FITC抗體的紅系分化K562細胞數(shù)目，確定T-2毒素對K562細胞紅系分化的細胞毒性。發(fā)現(xiàn)陰性對照丁酸鈉處理K562細胞后，隨孵育時間延長，細胞向紅系分化的數(shù)目顯著增加，且48 h誘導細胞紅系分化最顯著，為空白對照組的5.36±0.59倍。低濃度T-2毒素(5 nM)處理細胞后，同樣可以促進K562細胞向紅系細胞分化；高濃度T-2毒素(50 nM)處理細胞

5、后，則表現(xiàn)為顯著抑制K562細胞的紅系分化，48 h抑制作用最顯著，為0.23±0.03倍。在5～50 nM T-2毒素處理細胞48 h后，在T-2毒素濃度為15 nM時出現(xiàn)顯著抑制K562細胞分化作用。因此，在后續(xù)實驗中選擇48 h作為藥物作用的最佳時間，15 nM為毒素作用劑量。
　　 將熒光探針DCFH-DA加入與15 nM T-2毒素共孵育2h、4h、8h、12 h后的K562細胞中，用流式細胞儀檢測標記熒光探針的細胞，

6、確定T-2毒素作用下細胞內(nèi)ROS的釋放量。結(jié)果顯示，T-2毒素可以引起K562細胞內(nèi)ROS釋放呈現(xiàn)時間依賴性變化。T-2毒素在作用細胞4h時ROS釋放量最高，達到2.25±0.10倍，隨著T-2作用時間延長，ROS釋放量逐漸降低，恢復到正常水平。
　　 用15 nM T-2毒素，0.6 mM丁酸鈉和1 mM過氧化氫分別與K562細胞孵育48 h，用基因表達譜芯片檢測三種藥物對K562細胞mRNA表達量改變。結(jié)果顯示，與空白對照組

7、相比，T-2毒素組有1670個差異基因，其中上調(diào)的有653個(已知名稱和功能的基因有583個)，下調(diào)的有1017個(已知基因有398個)；丁酸鈉處理組有317個差異基因(已知基因占170個)，過氧化氫處理組有282個差異基因(已知基因占116個)。T-2毒素組與丁酸鈉組相比較有67個共同作用上調(diào)基因，56個共同的下調(diào)基因；T-2毒素組與過氧化氫組相比較有25個共同上調(diào)基因，167個共同的下調(diào)基因。將這些差異基因按生物學進程共分為9類：核

8、酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)代謝、能量代謝、細胞進程、造血相關(guān)、細胞轉(zhuǎn)運、細胞形態(tài)、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞應(yīng)激反應(yīng)。分析相關(guān)基因功能，我們推斷轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)及血紅素合成可能是T-2毒素的抑制造血細胞分化毒性的重要分子靶點；大量與細胞周期相關(guān)基因出現(xiàn)差異性表達，如cyclin B2、cyclinG1、cyclin G2、CDK2、ATM、cyclin D1等。另外，在流式細胞術(shù)測定毒素對K562細胞周期影響，結(jié)果顯示高濃度T-2毒素(15 nM)可以

9、引起細胞阻滯在S期，細胞周期阻滯使細胞增殖停止，造血祖細胞數(shù)目減少也會影響其分化數(shù)目，造成外周血液系統(tǒng)中各系血細胞數(shù)目降低；T-2毒素能誘導代謝相關(guān)基因差異表達，干擾K562細胞內(nèi)正常的物質(zhì)和能量代謝，造成細胞增殖與分化所需能量和物質(zhì)不足，導致K562細胞紅系分化能力降低，產(chǎn)生造血系統(tǒng)毒性作用；T-2毒素影響MAPK信號轉(zhuǎn)導通路和JAK-STAT信號通路激活，抑制K562細胞向紅系分化。RT-PCR確證基因芯片結(jié)果可靠，目的基因差異表達

10、趨勢相同，但是RT-PCR靈敏性高于基因芯片。
　　 雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)和飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)分析發(fā)現(xiàn)，與空白組細胞相比，T-2毒素作用后K562細胞共鑒定分析出22種差異蛋白質(zhì)，包括七類：基因修飾和修復蛋白，細胞轉(zhuǎn)運蛋白，細胞凋亡相關(guān)蛋白，分子伴侶，信號通路激酶因子，細胞內(nèi)物質(zhì)氧化還原蛋白以及細胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝相關(guān)蛋白。多個能量代謝中比較重要的酶類表達水平改變，如檸檬酸合酶、NADPH脫

11、氫酶和葡萄糖苷酶，提示T-2毒素影響了K562細胞內(nèi)正常的能量和物質(zhì)代謝過程。另外，DNA結(jié)合蛋白B、膜聯(lián)蛋白A1、細胞凋亡相關(guān)蛋白、蛋白酶激活因子、過氧化物氧還酶4、硫氧還蛋白依賴的氧化還原酶等其他蛋白質(zhì)在T-2毒素抑制造血細胞紅系分化中也發(fā)揮著協(xié)同作用。丁酸鈉和過氧化氫對照組也有大量與三羧酸循環(huán)和能量代謝相關(guān)蛋白差異性表達，如乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶、3-羥基乙酰CoA脫氫酶，蘋果酸脫氫酶、NADPH、丙酮酸激酶，表明陰性對照丁酸鈉誘導造血

12、細胞紅系分化和陽性對照過氧化氫抑制紅系分化中，都有能量代謝和物質(zhì)代謝變化參與其中，與基因芯片結(jié)果存在一定的相關(guān)性。用Western blot驗證HSP27蛋白的表達，結(jié)果與雙向電泳結(jié)果一致。
　　 綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)鐵蛋白及血紅素合成過程是T-2毒素抑制造血細胞分化過程中的重要分子靶點，JAK2-STAT5B參與了T-2毒素對造血系統(tǒng)毒性，并在T-2毒素引起K562細胞周期阻滯中有重要作用。細胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝相關(guān)基因和蛋