外源性Wnt5a誘導K562細胞定向分化的研究.pdf

1、目的： Wnt家族成員之一Wnt5a與其它家族成員一樣，在個體發(fā)育中必不可少，近來研究發(fā)現(xiàn)它與腫瘤發(fā)生密切相關，但確切關系和作用機制不明，特別是它與白血病發(fā)生的關系和作用罕見報道。本研究觀察了Wnt5a在髓細胞白血病病例和白血病細胞株中的表達情況，提示W(wǎng)nt5a表達缺失可能與白血病發(fā)生有關。進而以外源性Wnt5a處理髓系白血病細胞株K562，觀察其誘導K562細胞分化的作用。該研究為深入認識Wnt5a在白血病發(fā)生中的作用和機制打

2、下了基礎，并希望為白血病診斷提供新的腫瘤標志物和基因治療靶點。 方法： 1.應用RT-PCR方法檢測6例慢性髓細胞白血病患者和5例急性髓細胞白血病患者的骨髓或外周血標本，以及Jurkat、K562、HL-60等白血病細胞株中Wnt5a的表達。 2.應用HEK293細胞擴增帶有標記基因GFP的重組腺病毒AdWnt5a和對照AdGFP，并制備條件培養(yǎng)液：以AdWnt5a和AdGFP分別感染CHO細胞，16h后熒光顯微

3、鏡下檢測GFP表達，更換為低血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于48h后收集培養(yǎng)上清液，冷凍、干燥濃縮后，WesternBlot鑒定Wnt5a蛋白的表達。 3.分別以Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)K562細胞1～5d，并以臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)和總細胞計數(shù)，繪制生長曲線并進行統(tǒng)計學分析。 4.流式細胞儀分析Wnt5a條件培養(yǎng)液處理K562細胞1、3、5d時細胞周期的變化情況，并與對照組細胞進行比較。 5.將Wnt5a、

4、GFP條件培養(yǎng)液分別處理1～5d的K562細胞進行瑞姬氏染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)的改變，并在透射電鏡下觀察細胞超微結構的變化。 6.將Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液分別處理1～7d的K562細胞涂片固定，進行過氧化物酶(POX)、糖原(PAS)、α-醋酸萘酚(α-NAE)+氟化鈉抑制試驗的細胞化學染色，光鏡下觀察細胞陽性率并進行統(tǒng)計學分析。 7.將Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液分別處理1～7d的K562細胞涂片固定，利用免疫

5、細胞化學染色法檢測單核細胞表面分化抗原CD13、CD68的表達，和粒細胞表面分化抗原CD14的表達，計算陽性率并遄行統(tǒng)計學分析。 結果： 1.6例慢性髓細胞白血病病例均未表達Wnt5a，5例急性髓細胞白血病病例其中4例不表達或弱表達，僅1例高表達經(jīng)查為完全緩解的病例。在K562、HL-60髓系白血病細胞株中Wnt5a也不表達，而Jurkat細胞有高表達，與文獻報道一致，故以Jurkat作為實驗中的陽性對照。 2.

6、用HEK293細胞擴增得到高滴度的重組腺病毒AdWnt5a和AdGFP上清液。分別以AdWnt5a和AdGFP上清感染CHO細胞，以制備Wnt5a和GFP條件培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察到二者有較強的熒光信號，且Wnt5a條件培養(yǎng)液經(jīng)WesternBlot檢測出了Wnt5a蛋白的表達。 3.Wnt5a處理組、GFP對照組及未處理組的K562細胞，生長曲線顯示，Wnt5a明顯抑制K562細胞的增殖，但臺盼藍染色結果顯示未影響到細胞的存

7、活率。 4.Wnt5a條件培養(yǎng)液處理5d的K562細胞與對照組細胞比較，細胞周期的G2期增高了3.22倍，表明Wnt5a將細胞周期阻止在G2期。 5.光鏡下與對照相比，經(jīng)Wnt5a條件培養(yǎng)液處理的K562細胞：細胞體積縮小，核漿比減小，核染色質(zhì)濃縮，核仁減少或消失，有的核出現(xiàn)了凹陷，并且出現(xiàn)了個別具有典型單核細胞形態(tài)的細胞。超微結構的變化：細胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多，核仁減少或變小，胞質(zhì)增多，核漿比減小，細胞器明顯增多。

8、 6.Wnt5a處理后，K562細胞POX、PAS細胞化學染色的陽性率均明顯提高，且與對照組相比差異顯著。α-NAE染色呈強陽性，并且70％以上的陽性率可被氟化鈉所抑制。 7.Wnt5a處理組的K562細胞，其單核細胞系表面分化抗原CD14、CD68陽性率明顯高于GFP對照組，二者差異顯著；粒細胞系表面分化抗原CD13表達也增強，但與對照組比較無統(tǒng)計學意義。 結論： 1.RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，Wnt5a在9

9、0％的急、慢性髓細胞白血病和髓系白血病細胞株：K562、HL-60中均表達缺失，而在1例完全緩解的病例中有表達，提示W(wǎng)nt5a表達缺失可能與白血病的發(fā)生有關。 2.Wnt5a條件培養(yǎng)液處理的K562細胞，與對照組相比：細胞生長明顯受到抑制，細胞周期G2期明顯增高，提示W(wǎng)nt5a可能將K562細胞周期阻滯在G2期，使細胞不能進行正常的有絲分裂，從而抑制了細胞的增殖。 3.Wnt5a條件培養(yǎng)液處理后細胞形態(tài)上出現(xiàn)了分化的表型

10、，并觀察到了個別典型的單核細胞形態(tài)，超微結構也顯示有成熟的趨勢。POX、PAS、α-醋酸萘酚(α-NAE)+氟化鈉抑制的細胞化學染色結果表明，Wnt5a處理的K562細胞有向粒-單系統(tǒng)分化的現(xiàn)象。檢測單核細胞系表面標志抗原CD14、CD68的免疫細胞化學染色結果，則進一步證實了外源性的Wnt5a可誘導K562細胞向單核細胞系分化的趨勢。 以上研究提示，Wnt5a表達缺失可能是髓細胞白血病發(fā)生的原因之一，Wnt5a可能在其中起到了