甜菜素類生物堿誘導(dǎo)K562白血病細胞分化凋亡的研究.pdf

1、本論文對商陸（PhytolaccaAmericanaL）果實中甜菜素類生物堿的主要成分的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)確證、含量測定、誘導(dǎo)K562白血病細胞株凋亡分化體外活性進行了研究，結(jié)果如下：
　　1、優(yōu)化商陸果實紅色素的超聲提取工藝
　　采用正交試驗設(shè)計，用超聲波法提取商陸果實紅色素。結(jié)果表明，超聲波法最佳提取工藝為提取時間為30min、固液比為1:4（g：mL）、pH值為3、提取2次。超聲波提取法具有省時、簡便、效率高等優(yōu)點，

2、適合大生產(chǎn)應(yīng)用。
　　2、篩選出大孔樹脂分離商陸紅色素的工藝
　　對5種大孔樹脂提取商陸紅色素進行比較，考察經(jīng)AB-8大孔樹脂分離的條件以及分離后乙醇沉淀商陸紅色素的最佳工藝條件。AB-8大孔樹脂吸附商陸紅色素效果最好，其最佳工藝條件為：吸附流速2.0mL/min、上樣pH值為3、洗脫劑濃度為15％乙醇溶液、洗脫流速0.7mL/min；乙醇沉淀純化商陸紅色素的最佳工藝為：洗脫液濃縮50倍，濃縮液：乙醇為1:10，沉淀3次。經(jīng)

3、過AB-8大孔樹脂提純后，乙醇沉淀不僅能夠除去大部分雜質(zhì)，而且大大提高了商陸紅色素的品質(zhì)。
　　3、SephadexLH-20純化商陸紅色素
　　優(yōu)選SephadexLH-20純化商陸紅色的工藝條件。其最佳工藝條件為：上樣體積為5mL、線性流速為7.15cm/h、流動相pH值為3。SephadexLH-20不僅能夠除去大部分雜質(zhì)，而且大大提高了商陸紅色素的品質(zhì)。
　　4、商陸紅色素的pre-HPLC制備及HPLC分析<

4、br>　　從SephadexLH-20樣品中分離純化甜菜素，純化甜菜素的半制備色譜條件為:半制備型色譜柱：CrestODSPN：Co218050-212250（5μm,21.2mm×250mm）流動相甲醇-水（0.5%甲酸）=18：82，流速10mL/min，柱溫室溫，SPD-M10A二極管陣列檢測器，進樣量2.0mL。分析甜菜素的色譜條件為：色譜柱SinoChromODS-Bp(5μm,4.6mm×150mm)，流動相0-30min1

5、0%-30%甲醇-水(0.5%甲酸)梯度、30-60min10%甲醇-水(0.5%甲酸)，流速1.0mL/min，柱溫室溫，SPD-M10A二極管陣列檢測器，進樣量10μL。
　　5、甜菜素類化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)確證
　　采用超聲波提取、大孔吸附樹脂、SephadexLH-20和制備液相色譜方法，分離得到1個化合物，經(jīng)有機波譜（紫外吸收光譜、電噴霧質(zhì)譜、核磁共振波譜）分析鑒定為甜菜苷。
　　6、甜菜素含量測定方法
　　

6、篩選出了紫外可見光分光光度計法和高效液相色譜法同時測定甜菜素含量的方法。紫外可見光分光光度計法測定甜菜素含量，其結(jié)果顯示，商陸果實紅色素在0.01~0.05mg/mL范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.00478X+0.00566，r=0.9995；色譜條件為：色譜柱SinoChromODS-Bp(5μm,4.6mm×150mm)，流動相0-30min10%-30%甲醇-水(0.5%甲酸)梯度、30-60min10%甲

7、醇-水(0.5%甲酸)，流速1.0mL/min，柱溫室溫，SPD-M10A二極管陣列檢測器，進樣量10μL。結(jié)果顯示，線性范圍為：甜菜苷在6.00～22.00μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1016425.225X+1824551.050，r=0.9996。該方法簡便、可靠，適于甜菜素類成分的含量測定和質(zhì)量控制。
　　7、甜菜苷體外誘導(dǎo)K562白血病細胞株分化凋亡活性研究
　　本文研究從商陸果實中分離出來的甜菜紅色素甜

8、菜苷抗人類白血病細胞株K562活性。結(jié)果表明，甜菜苷抑制K562白血病細胞的增值隨濃度與時間成反比，藥物作用24h、48h、72h的IC50分別為6.395、5.304、4.796μM。熒光顯微鏡和細胞形態(tài)學(xué)的進一步研究表明，甜菜苷作用K562細胞后有染色質(zhì)濃縮、細胞收縮、細胞膜空化等細胞凋亡特征的出現(xiàn)。DNA碎片的凝膠電泳出現(xiàn)有規(guī)律的DNA梯形圖，表明甜菜苷作用的細胞出現(xiàn)了凋亡。濃度1-10μM作用細胞，流式細胞儀分析細胞周期的變化發(fā)