雌激素受體GPR30對(duì)黑素合成的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　研究雌激素膜受體G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein—coupled receptor30，GPR30)對(duì)黑素合成的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.應(yīng)用半定量RT-PCR和Western Blot的方法測(cè)定GPR30在人A375細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.選取不同濃度的GPR30激動(dòng)劑G-1及不同強(qiáng)度UVA作用于A375細(xì)胞，雌二醇處理作為陽(yáng)性對(duì)照。MTT法測(cè)定作用后A375細(xì)胞細(xì)胞增殖的變化

2、，選取最佳藥物濃度段和照光強(qiáng)度;并在最佳照光強(qiáng)度下，選取不同濃度GPR30拮抗劑G-15作用于A375細(xì)胞，MTT法選取最佳G-15藥物最佳濃度段。
　　3.根據(jù)MTT結(jié)果，在G-1藥物最佳濃度段內(nèi)選取0.2μM，0.4μM，0.8μM三個(gè)濃度，雌二醇處理作為陽(yáng)性對(duì)照; NaOH溶解法檢測(cè)其作用24h后黑素合成量，同時(shí)分別檢測(cè)G-1處理后24h，48h，72h黑素合成量變化，檢測(cè)其酪氨酸酶活性;同時(shí)應(yīng)用WesternbBlot的方

3、法測(cè)定酪氨酸酶及小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associatedtranscript-Ion factor, MITF)在蛋白水平表達(dá)。
　　4.根據(jù)MTT結(jié)果，在照光后G-15藥物最佳濃度段內(nèi)選取0.2μM，0.4μM，0.8μM三個(gè)濃度。NaOH溶解法檢測(cè)其作用24h后黑素合成作用，檢測(cè)其酪氨酸酶活性;同時(shí)應(yīng)用Western Blot的方法測(cè)定酪氨酸酶及MITF蛋白水平表達(dá)。
　　5.使用ShGP

4、R30質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)GPR30表達(dá)，NaOH溶解法檢測(cè)其UVA照射后黑素合成量改變，并檢測(cè)其酪氨酸酶活性;同時(shí)應(yīng)用Western Blot的方法測(cè)定其UVA照射前后酪氨酸酶及MITF蛋白水平表達(dá)改變。
　　6.構(gòu)建過表達(dá)GPR30的A375細(xì)胞模型，NaOH溶解法檢測(cè)其黑素合成量，檢測(cè)其酪氨酸酶活性;同時(shí)應(yīng)用Western Blot的方法測(cè)定酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.GP

5、R30在mRNA水平及蛋白水平均在人A375細(xì)胞中有明顯表達(dá)。
　　2.G-1在10-3μM到1μM濃度促進(jìn)人黑素瘤細(xì)胞的增殖(p≤0.05)，最終選取0.2μM，0.4μM，0.8μM三個(gè)濃度點(diǎn)。5 J/cm2到60 J/cm2強(qiáng)度內(nèi)的UVA照射后，能促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖(p≤.05），而這一作用在30 J/cm2時(shí)最明顯，最終選取UVA30J/cm2處理A375細(xì)胞，在這一強(qiáng)度下，G-15在10-3μM到1.5μM濃度下抑制人

6、黑素瘤細(xì)胞的增殖，最終選取0.2μM，0.4μM，0.8μM三個(gè)濃度點(diǎn)。
　　3.不同濃度濃度G-1（0.2μM，0.4μM，0.8μM）處理A375細(xì)胞24小時(shí)后，黑素合成及酪氨酸酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，GPR30激動(dòng)劑G1對(duì)黑素合成及酪氨酸酶活性有促進(jìn)作用，并存在一定濃度依賴趨勢(shì)。而在24h，48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，0.8μM G-1對(duì)黑素合成的影響無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，無明顯時(shí)間依賴趨勢(shì)。Western Blot結(jié)

7、果顯示G-1能促進(jìn)酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表達(dá)，并且這種促進(jìn)作用呈濃度依賴趨勢(shì)。
　　4.在30J/cm2 UVA照射后，不同濃度濃度G15(0.2μM，0.4μM，0.8μM)處理A375細(xì)胞24小時(shí)，黑素合成及酪氨酸酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，照光對(duì)人A375細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性有明顯促進(jìn)作用，而GPR30拮抗劑G15能抑制照光后的促進(jìn)黑素合成作用，并存在一定濃度依賴趨勢(shì)。Western Blot結(jié)果顯示照光能促進(jìn)酪氨酸酶及

8、MITF在蛋白水平表達(dá)，而G-15處理后能呈濃度依賴趨勢(shì)的抑制這種促進(jìn)作用。
　　5.抑制GPR30表達(dá)的A375細(xì)胞，予UVA照射后，黑素合成及酪氨酸酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示抑制GPR30表達(dá)的A375細(xì)胞其黑素合成及酪氨酸酶活性低于空載照光組A375細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，抑制組內(nèi)照光后酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表達(dá)均較空載照光組細(xì)胞低。
　　6過表達(dá)GPR30的A375細(xì)胞，其黑素合成能力及酪氨酸酶活性