牦牛奶酪中乳酸菌的表型、基因型和益生特性的研究.pdf

1、牦牛奶酪乳酸菌是我國重要而且獨特的生物資源，有極其重要的收集、整理、保存、研究的價值。本研究從西藏、云南、新疆三個地區(qū)采集17份牦牛奶酪樣品，分離純化出了其中的乳酸菌，研究了乳酸菌的表型、基因型和益生特性。
　　 表型特性的研究即用傳統(tǒng)的菌落形態(tài)、革蘭氏染色顯微形態(tài)、生理生化、在不同環(huán)境（溫度、pH值、鹽度）中的生長特生，碳水化合物發(fā)酵方式等實驗項目，將乳酸菌劃分到屬，進(jìn)而初步判斷出菌種，此外，還分析了產(chǎn)酸活性、利用檸檬酸鹽等表

2、型特性，以獲得乳酸菌的基本數(shù)據(jù)，
　　 基因型特性的研究包括16S rRNA序列分析和隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)。本研究建立了屬特異性PCR→16S rRNA序列分析→種特異性PCR的快速鑒定模式，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，以分析乳酸菌菌株的遺傳親緣關(guān)系。建立了適用于乳酸菌的RAPD反應(yīng)體系和程序，用于分離鑒定出的乳酸菌，用NTsys2.10e軟件對其圖譜做聚類分析，與16S rRNA序列分析的結(jié)果相比較，分析菌株之間的遺傳親緣關(guān)系，分析

3、菌株聚類方式與地域之間的相關(guān)性。
　　 益生特性的研究包括乳酸菌菌株的產(chǎn)細(xì)菌素、產(chǎn)胞外多糖、產(chǎn)葉酸、降膽固醇的益生特性，并研究了菌株對抗生素的抗性、體內(nèi)環(huán)境的耐受性、黏附活性，篩選出有突出益生功能，抗逆性較好的菌株，有希望作為益生菌加以開發(fā)應(yīng)用。
　　 主要的研究結(jié)果如下:
　　 (1)西藏、云南、新疆三個地區(qū)的樣品平均pH值分別為4.31±0.39;4.69±0.29;4.52±0.22，地區(qū)之間不存在顯著性差

4、異(P=0.176＞0.05)，三個地區(qū)菌落計數(shù)平均值分別為4.17±0.43;4.30±0.68;3.9±0.59 log CFU/g，也不存在顯著性差異(P=0.468＞0.05)。
　　 (2)從17份樣品中分離出39株乳酸菌，通過表型方法初步判斷出菌種。35株菌為桿菌，被分為7個菌種:L.buchneri2株(Y15，Y16)，L.casei16株(T7， Y19, X21, X22, X23, X26, X27, X2

5、8, X29, X30, X31, X32, X33, X34, X35, Y36),L.diolivorans3株(Y18,X24,X25),L.fermentum3株(T1,T2,T3)，Lhelveticus3株(T6,T8,Y9),L.kefiri3株(Y10,Y12,Y20),L.plantarum5株(T4,Y13,Y37,X38，X39)。4株菌為球菌，被分為2個菌種:Pediococcus acidilactici1株(

6、T5)，Pediococcus pentosaceus3株(Y11、Y14、Y17)。
　　 (3)本研究測出6株乳桿菌產(chǎn)酸活性達(dá)到了起酵菌株的標(biāo)準(zhǔn):X24、X38、X29、X25、X21、X22。選出發(fā)酵檸檬酸鹽活性較強的菌株有:T4、T7、Y10、Y13、X25、X28、Y36、Y37，這些菌株的優(yōu)良特性是在長期適應(yīng)環(huán)境、以及生產(chǎn)實踐中積累形成的。
　　 (4)16S rRNA序列分析:將39株乳酸菌用16S rRN

7、A序列分析法鑒定到種，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步驗證了菌種的劃分，與表型特性是一致的。
　　 (5)隨機擴(kuò)增多態(tài)性研究:做出了39株乳酸菌的RAPD指紋圖譜，除X23、Y36和Y37之外，其余菌株均按照不同的菌種聚類，與16S rRNA序列分析法得出的結(jié)果基本是一致的，菌株聚類方式與地域有較強的相關(guān)性，說明RAPD技術(shù)在分類鑒定中有一定的應(yīng)用價值，可解析菌株之間的遺傳親緣關(guān)系。
　　 (6)檢出31株菌產(chǎn)細(xì)菌素，菌株Y1

8、3能夠拮抗5種致病菌:Bacillus cereus ATCC10876、Escherichia coli 0157:H7、Listeria monocytogenes、Citrobacter freundii ATCC 8090、Salmonella Typhimurium ATCC 13311，抑菌譜最寬X29和X30能拮抗4種致病菌:Bacillus cereus ATCC 10876、Citrobacterfreundii AT

9、CC 8090、Salmonella Typhimurium ATCC 13311、Enterobacter cloacae ATCC23355。所有乳酸菌細(xì)菌素對嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus都沒有拮抗活性，在發(fā)酵乳制品時，這些乳桿菌可與嗜熱鏈球菌合用，相互之間沒有拮抗作用。
　　 (7)篩選出產(chǎn)胞外多糖的菌株有T3、T4、T5、T7、T8、Y11、Y14、Y17、X29，用苯酚-硫酸法定量檢測

10、所有篩出菌株的產(chǎn)量，與文獻(xiàn)報道的產(chǎn)量相比處于中等水平，最高產(chǎn)菌株T8產(chǎn)量為193.72mg/L。
　　 (8)篩選出9株菌可以產(chǎn)葉酸:T3、T7、T8、X23、X25、X26、X27、X29、Y37。最高產(chǎn)的菌株是Y37，總產(chǎn)量達(dá)到了85.98±5.09 ng/ml，其次是X25，總產(chǎn)量為81.17±2.08 ng/ml，與文獻(xiàn)報道的產(chǎn)率17～100ng/ml相比，本實驗篩選出來的菌株X25和Y37已達(dá)到了很高的產(chǎn)量。
　

11、　 (9)研究了乳酸菌在MRS-CHOL培養(yǎng)基中對膽固醇去除率，Y15、X25和X27對膽固醇降解率分別為45.59％，50.01％和53.18％，都達(dá)到40％以上，與文獻(xiàn)報道過的乳酸菌菌株相比屬于比較高的水平。
　　 (10)用紙片擴(kuò)散法測了39株菌對抗生素的抗性。39株乳酸菌對氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素敏感的菌株分別占74.4％;82.1％和82.1％，對萘啶酮酸、鏈霉素、萬古霉素和新霉素有抗性的菌株分別占100％;97.

12、4％;92.3％和82.05％。
　　 (11)對體內(nèi)環(huán)境耐受性很強菌株有3株:Y15、X25和X27，粘附性也很好。
　　 (12)本研究鑒定并篩選出3株乳酸菌能耐受體內(nèi)環(huán)境、有可能定植于腸道中，并有特定的保健功能，有可能作為益生菌開發(fā)。Y15（L.buchneri）能產(chǎn)胞外多糖（50.26±1.25mg/L），降膽固醇(去除率為45.59％)，對萘啶酮酸、鏈霉素、萬古霉素有抗性。X25（L.diolivorans）能

13、產(chǎn)葉酸（81.17±2.08ng/mL），能降膽固醇（去除率為50.01％），對萘啶酮酸、鏈霉素、四環(huán)素、萬古霉素有抗性。X27（L.casei）能產(chǎn)胞外多糖（38.62±1.21mg/L），產(chǎn)葉酸（77.83±2.52ng/mL），能降膽固醇（去除率為53.8％），所產(chǎn)細(xì)菌素對Bacillus cereus ATCC10876、Staphylococcus aureus、Escherichia coli O157:H7有拮抗活性，對新

14、霉素、萘啶酮酸、鏈霉素、萬古霉素有抗性。
　　 本論文的創(chuàng)新之處在于:
　　 (1)牦牛奶酪乳酸菌是我國重要而且獨特的生物資源，有極其重要的收集、整理、保存、研究的價值。本研究是對牦牛奶酪中的乳酸菌進(jìn)行的最完整、系統(tǒng)、全面的基礎(chǔ)研究。
　　 (2)建立了屬特性PCR→16S rRNA序列分析→種特異性PCR的菌種鑒定模式，可用于對大量野生菌株快速鑒定菌種，能有效提高鑒定效率和準(zhǔn)確性。
　　 (3)構(gòu)建了重