豬源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥表型與基因型的研究.pdf

1、近十幾年來,為防治疾病及促進生長,大量抗菌藥物應(yīng)用于集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中?？咕幬镩L期、廣泛和不合理使用以及抗菌藥物的選擇壓力等原因使大腸桿菌和沙門氏菌耐藥菌株不斷增多、耐藥譜不斷擴大,有的菌株甚至對尚未用于臨床的新型抗菌藥物也表現(xiàn)出了耐藥性。因此,積極開展豬源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性監(jiān)測,闡明耐藥表型與基因型特征,將有利于遏制大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性發(fā)生發(fā)展,優(yōu)化抗菌藥物的合理應(yīng)用。本文采集浙江省規(guī)?；i場患病豬只的病料,經(jīng)細菌分離純化、

2、致病性試驗、生化試驗和PCR鑒定等,共獲得79株病原性大腸桿菌和35株沙門氏菌。通過WHO推薦的Kirby-Bauer(K-B)法測定其對21種抗菌藥物的耐藥性。
　　結(jié)果表明,大腸桿菌僅對頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢噻肟和多粘菌素B敏感性較高,而對大部分抗菌藥物表現(xiàn)出較高的耐藥性,其中對苯唑西林、利福平、復(fù)方新諾明、強力霉素、羧芐西林、氨芐西林、阿莫西林、鏈霉素及氯霉素的耐藥率均超過90％,其次是對慶大霉素、環(huán)丙沙星、新霉素、恩諾沙

3、星、諾氟沙星、阿莫西林/克拉維酸及氟苯尼考的耐藥率均超過50%。進一步的耐藥譜分析表明,79株大腸桿菌分離株全部為耐藥菌,其中以對16～18種抗菌藥物多重耐藥最為突出(60.8%,48/79);相對于大腸桿菌,沙門氏菌除了對苯唑西林和利福平耐藥率為100%外,對其余抗菌藥物的耐藥率均低于50%。其中對頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢噻肟、阿米卡星、諾氟沙星及多黏菌素B的敏感率均為100%,對慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、壯觀霉素、氟苯

4、尼考、氨芐西林、新霉素和復(fù)方新諾明的敏感率超過80%,對恩諾沙星和氯霉素的敏感率超過60%。35株沙門氏菌雖然同樣對1種或多種抗生素耐藥,但多重耐藥頻數(shù)顯著低于大腸桿菌,主要表現(xiàn)為對2～4種抗菌藥物多重耐藥。Touch-down PCR擴增隨機挑選的26株病原性大腸桿菌和35株沙門氏菌分離株,檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(extended-spectrum beta-lactamases, ESBLs)(TEM, SHV, OXA)、氨基

5、糖苷類藥物耐藥基因(aadA1、aadA2、aadB、aadD、aph(3’)-Ⅱa、aacC2、aacC4、aac(3)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa、磺胺類耐藥基因(sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ)、氯霉素類耐藥基因(Cat1、Cat2、CmlA、CmlB、Flor)、四環(huán)素類耐藥基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG),結(jié)果表明,26株大腸桿菌中耐藥基因sulⅡ、TEM、aph(3’)-Ⅱa、aacC2、Cat

6、1、Cat2、aac(3)-Ⅱa、tetB、tetE、aadA2和sul I較為普遍,檢出率率分別為96.2%、88.5%、80.8%、69.2%、69.2%、69.2%、65.4%、65.4%、61.5%、57.7%和50%,耐藥基因Flor、CmlA、aadA1、tetA、sulⅢ和aadB的檢出率分別為34.6%、26.9%、19.2%、19.2%、11.5%和3.9%。未能檢測到SHV、OXA、aadD、aacC4、aac(3)

7、-Ⅰa、tetC、tetD、tetG和CmlB基因。沙門氏菌含有的耐藥基因類型沒有大腸桿菌多,且耐藥基因的檢出率較低,tetA、TEM、sulⅡ、aacC2、Cat1、Cat2、tetB、aph(3’)-Ⅱa、sulⅠ、aadA2、aac(3)-Ⅱa和tetG的檢出率分別為28.6%、20%、20%、17.1%、17.1%、17.1%、11.4%、8.6%、8.6%、2.9%、2.9%和2.9%。未能檢測到SHV、OXA、aadA1、a

8、adB、aadD、aacC4、aac(3)-Ⅰa、sulⅢ、tetC、tetD、tetE、CmlA、CmlB、Flor基因。分別采用微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法測定恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對由K-B法篩選出的豬源沙門氏菌敏感株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和防突變濃度(mutant prevention concentration,MPC),并計算耐藥選擇指數(shù)(selectio

9、n index, SI=MPC/MIC)。試驗結(jié)果表明,恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對沙門氏菌的MIC分別為0.031～0.5μg/mL和0.031～0.13μg/mL,敏感率均為100%,與K-B法試驗結(jié)果一致。恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對敏感菌的MPC分別分布于1～4μg/mL和0.25～1μg/mL,鹽酸環(huán)丙沙星對沙門氏菌的SI值(8～16)低于恩諾沙星(16～32),因此認為鹽酸環(huán)丙沙星不僅抗菌活性較高,其防耐藥突變能力也強于恩諾沙星。本

10、研究表明,浙江省規(guī)模化豬場豬源病原性大腸桿菌的耐藥性已相當(dāng)嚴重,耐藥基因種類多、檢出率高;而豬源沙門氏菌的耐藥程度相對較低,對很多抗菌藥物的敏感性高,耐藥基因種類較少,檢出率低。恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對豬源沙門氏菌的防突變能力有一定差異,因此,為減少和控制耐藥性的發(fā)生發(fā)展,在臨床使用抗菌藥物時不僅要參考抗菌藥物對病原菌的MIC,還要重視菌株的MPC及突變選擇窗(mutant selection window,MSW),以防止耐藥突變菌選