豬源致病性沙門氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測技術(shù)研究.pdf

1、本研以30株豬源致病性沙門氏菌為檢測菌株，進行了各菌株的血清型鑒定，測定了該30株細菌對四大類抗生素的最低抑菌濃度，建立了其耐藥基因的PCR檢測技術(shù)，構(gòu)建了耐藥基因的基因檢測芯片，建立了基因芯片檢測技術(shù)，對30株沙門氏菌的耐藥基因進行了檢測，主要內(nèi)容包括以下4個方面： 1、以豬源致病性沙門氏菌為被檢菌株，采用玻片凝集試驗進行了菌株的血清型鑒定，結(jié)果30株菌分屬豬傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和德爾俾沙

2、門氏菌5個血清型。根據(jù)GenBank上注冊的耐藥基因序列，采用DNAStarPrimerselect軟件設(shè)計了24對引物，對沙門氏菌氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類和氯霉素類四大類抗生素的24種耐藥基因進行了擴增，建立了耐藥基因的PCR檢測方法。對擴增到的11種DNA產(chǎn)物進行了序列測定，采用DNAStarMegAlign軟件，將擴增到的DNA產(chǎn)物同GenBank上注冊的相應耐藥基因進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)它們之間有很高的同源率(≥95.9％)。

3、 2、采用平板稀釋法，選用氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類和氯霉素類四大類抗革蘭氏陰性菌的11種抗生素，對30株豬源致病性沙門氏菌進行了藥敏試驗，結(jié)果有28株菌至少對一種藥物有耐藥性(93.3％，28/30)；對四環(huán)素、強力霉素、磺胺甲基異惡唑、復方新諾明、鏈霉素、卡那霉素和氯霉素有耐藥性的菌株較普遍，在所有菌株中占的比例分別為83.3％(25/30)、80％(24/30)、80％(24/30)、76.7％(23/30)、60％(1

4、8/30)、56.7％(17/30)和56.7％(17/30)。采用已經(jīng)建立的PCR檢測技術(shù)，對30株豬源致病性沙門氏菌的11種耐藥基因進行了檢測，結(jié)果至少含有一種耐藥基因的有28株(93.3％，28/30)，sulⅠ、aph(3')-Ⅱa、tetC、Cat1、tetA和aadA1耐藥基因較為普遍，檢出率分別為76.7％(23/30)、60％(18/30)、60％(18/30)、43.3％(13/30)、40％(12/30)和36.7％

5、(11/30)。將藥敏試驗結(jié)果與耐藥基因檢測結(jié)果進行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間有很高的一致性(≥88％)。其中6株耐氟甲砜霉素的菌株中都檢測到了floR基因，符合率達到了100％。 3、以11種耐藥基因作為靶基因、細菌保守的16srRNA為定位基因、青霉素抗性基因BlaTEM-1為陽性內(nèi)參，構(gòu)建了耐藥基因檢測芯片。確定芯片點樣環(huán)境溫度為25℃、濕度為65％，各樣點中心距離為1000μm，樣點直徑為220μm。 4、在構(gòu)

6、建的耐藥基因基因芯片的基礎(chǔ)上，進一步對耐藥基因的基因芯片檢測技術(shù)進行了研究。首先將11種耐藥基因引物組合成四組，即MP1(aph(3')-Ⅱa+aadA1+tetC)、MP2(aadB+tetA+floR)、MP3(aadA2+CmlA+Cat1)和MP4(sulⅠ+sulⅡ)，建立了耐藥基因的多重PCR擴增標記方法。將各組合PCR擴增產(chǎn)物與芯片雜交，在對應基因點樣處均出現(xiàn)陽性雜交信號，表明耐藥基因多重PCR擴增標記和雜交獲得成功。。本