LDR-PCR基因芯片檢測混合感染豬病毒研究.pdf

1、隨著全球經(jīng)濟一體化進程的加快,動物的國際貿(mào)易日益頻繁,貿(mào)易規(guī)模越來越大,經(jīng)典的血清學和PCR檢測方法已經(jīng)無法適應進口動物檢疫快速、準確、高通量的要求。在很多檢測領域都急需一種能同時對多種病原微生物進行檢測和鑒定的方法。本研究建立了一種基于LDR-PCR基因芯片技術(shù)可同時對六種與呼吸、繁殖疾病相關的豬病毒進行鑒定的檢測方法。LDR-PCR方法用于特異和靈敏地擴增病毒基因片段,基因芯片方法有助于實現(xiàn)方法的多重性。連接酶檢測反應(LDR)使用

2、耐熱的DNA連接酶,當探針與目的DNA互補配對后,連接酶能通過催化磷酸二酯鍵將相鄰的兩條探針連接,當探針的接頭處存在堿基錯配,連接反應便不能進行。這種方法顯著減少了探針非特異性連接,被廣泛用于檢測病原體基因突變、插入和缺失等。基因芯片技術(shù)最早用于監(jiān)控基因表達和DNA序列特異性的點突變,目前較多地應用于環(huán)境和臨床中的病原微生物檢測鑒定。基因芯片為分子診斷技術(shù)帶來巨大的革命,不僅提高了檢測能力,同時也增加了檢測的通量。雖然這種技術(shù)具有高通量

3、、高集成及微型化的突出優(yōu)點,但仍有一些不足,如靈敏度和特異性不高。
　　 本文在整合LDR、PCR和基因芯片技術(shù)的基礎上建立了一種同時檢測六種豬病毒的方法。首先,從NCBI中查找并下載六種豬病毒的全序列,通過軟件比對確定每種病毒序列的保守區(qū),根據(jù)其保守序列設計一組LDR探針,每組探針由五段序列組成,從左到右依次是:上游通用序列,上游病毒特異序列,下游病毒特異序列,Zip-code序列和下游通用序列。提取基因組DNA/RNA,以提

4、取出的DNA或反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板進行多重LDR,并以含病毒診斷區(qū)的質(zhì)粒作為標準模板對多重連接反應體系進行了優(yōu)化,研究了最佳的反應條件。利用通用引物擴增標記連接產(chǎn)物,最后將擴增標記產(chǎn)物與通用芯片雜交檢測鑒定靶標序列。本研究建立的基于LDR-PCR基因芯片檢測方法可以同時區(qū)分六種豬病毒,LDR探針和Zip-code序列的特異性良好,只在芯片目的位點產(chǎn)生信號,其它位點無信號。此方法的檢測靈敏度達到10個拷貝,存在兩種靶基因時,其中一種病