豬博卡病毒多重PCR檢測和分型研究.pdf

1、豬博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是無囊膜單鏈線狀DNA博卡病毒屬成員。自2009年在瑞典患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)豬體內(nèi)被檢測出后，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，多個病毒種或基因型被發(fā)現(xiàn)，依據(jù)系統(tǒng)進化關(guān)系可分為G1，G2，G3三個PBoV基因群組。這一新發(fā)豬病毒引起了各國的普遍關(guān)注，但人們對其研究仍處于初級的探索階段，PBoV的檢測和分型方法并不全面。因此發(fā)展有效和可靠的檢測技術(shù)對PBoV流行病學(xué)調(diào)查分析非

2、常重要。在本研究中，分別構(gòu)建了PBoV普通多重PCR和EvaGreen多重實時熒光PCR檢測方法并應(yīng)用于臨床樣品檢測。
　　本研究中，在對三個基因群組基因組序列進行同源性分析的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計特異性引物，首先構(gòu)建了一個普通多重PCR方法用于同時檢測和鑒定不同分型的PBoV。此方法可特異地檢測三個PBoV基因群組，對PBoVG1，PBoV G2和PBoV G3檢測靈敏度分別為1.0×103，4.5×103和3.8×103 copie

3、s/μL，與三個PBoV基因群組普通單重PCR的靈敏度1.0×103 copies/μL相近。利用新建立的多重PCR檢測方法來檢測227個臨床樣品。PBoV G1，PBoV G2和PBoV G3檢測陽性率分別為1.3％，2.6%和12.3%。其中三個基因群組檢測有混合感染，PBoV G1與 PBoVG3、PBoV G2與PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3混合感染檢出率分別為0.4%、0.9%和0.4%。除在豬

4、糞樣品中多檢測出一個PBoV G2陽性外，PBoV基因群組單重PCR結(jié)果與多重PCR結(jié)果相同。
　　建立的基于EvaGreen PBoV單重或多重實時熒光PCR擴增后經(jīng)熔解曲線分析，三個基因群組的擴增產(chǎn)物均形成特異熔解峰，PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3的Tm值分別為81.3±0.34°C，78.2±0.37°C和85.0±0.29°C，各病毒間Tm值間隔在3°C左右，而非靶標(biāo)病毒及空白陰性對照無特異熔解峰產(chǎn)生，通過

5、Tm差異可區(qū)分鑒定三個PBoV基因群組，表明建立的方法具有良好的特異性。三個基因群組EvaGreen單重實時熒光PCR檢測靈敏度分別為25copies/μL(PBoV G1)，10 copies/μL(PBoV G2)和25 copies/μL(PBoV G3)；而EvaGreen多重實時熒光PCR體系下單個基因群組的檢測靈敏度稍有下降，依次為100copies/μL(PBoV G1)、50 copies/μL(PBoV G2)和100

6、 copies/μL(PBoV G3)；三個基因群組同時存在時EvaGreen多重實時熒光PCR檢測靈敏度依次為250 copies/μL(PBoV G1)，250copies/μL(PBoV G2)和100copies/μL(PBoV G3)。EvaGreen單重實時熒光PCR和EvaGreen多重實時熒光PCR的重復(fù)性試驗變異系數(shù)都小于5%，具有較好的重復(fù)性。EvaGreen多重實時熒光PCR對227個樣品檢測結(jié)果為：PBoV G1

7、陽性率為15.0%，PBoV G2的陽性率為25.1%，PBoV G3的陽性率為41.9%，與利用EvaGreen單重實時熒光PCR檢測的17.2% PBoV G1，29.1% PBoV G2和44.5% PBoV G3陽性率結(jié)果較為一致；其中，PBoV G1與PBoV G2、PBoV G1與 PBoV、G3PBoV G2與PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3混合感染檢出率分別為3.1%、5.7%、13.2%及

8、3.1%。上述結(jié)果表明PBoV在國內(nèi)豬群中較流行。
　　對PBoV檢測陽性的樣品進行克隆測序，并將測得的目的片段序列分別與PBoV全基因組序列或者接近全基因組序列間的核苷酸序列進行基因序列比對、同源性和系統(tǒng)進化樹分析。結(jié)果顯示三組PBoV基因群組內(nèi)的同源性比較高，范圍在72.1-100%之間，而基因群組間的核苷酸序列同源性較低為3.2-54.2%，表明將本研究構(gòu)建的普通多重PCR和EvaGreen多重實時熒光PCR兩組PBoV檢測

9、方法選擇的診斷區(qū)區(qū)分PBoV G1、PBoV G2與PBoVG3三個基因群組的基因分型方法可行且具有代表性，同時證實豬群中PBoV具有較高的遺傳多樣性。
　　本研究成功構(gòu)建立了普通多重PCR和EvaGreen多重實時熒光PCR兩組PBoV檢測和分型方法，可以滿足不同調(diào)查和研究的檢測需求，這兩組多重PCR檢測方法能最大限度地節(jié)約檢測時間，提高工作效率，適合養(yǎng)豬場大批量檢測需求，為PBoV的流行病學(xué)調(diào)查研究和臨床檢測提供了良好的檢測技