主要蚊媒及流感病毒甄別檢測(cè)基因芯片的研制.pdf

1、背景：
　　蚊媒病毒是一類通過蚊類傳播給恒溫脊椎動(dòng)物的病毒。全球范圍內(nèi)影響最大的幾種蚊媒病毒包括:登革熱病毒、日本腦炎病毒、黃熱病病毒、西尼羅河病毒、基孔貢亞熱病毒等。多種蚊媒病毒已被列為生物戰(zhàn)劑而進(jìn)行防控。除了傳播病毒外，蚊類攜帶和傳播的瘧原蟲和淋巴系統(tǒng)絲蟲也是目前全球范圍內(nèi)最為重要的寄生蟲疾病。由于廣泛的流行和危害，瘧疾和淋巴系統(tǒng)絲蟲病被列為全球最優(yōu)先控制和消除的疾病。蚊媒病原體這種具有從其存在地區(qū)突然傳播入新地區(qū)的能力使得持

2、續(xù)監(jiān)測(cè)具有重要的意義。在我國，蚊媒病原體是高溫、草地、叢林等戰(zhàn)區(qū)尤其是邊境地區(qū)重要的傳染病病原體，其引起的多種傳染病嚴(yán)重影響部隊(duì)作戰(zhàn)能力和人民日常生活?！霸\”、“防”、“治”三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)構(gòu)成了完整的疾病預(yù)防控制鏈，其中“診”不僅是疾控鏈中不可缺少的關(guān)鍵一環(huán)，而且也是有效防治的前提。
　　流感病毒分為A、B、C三種型別。目前，臨床上有兩類廣泛使用的抗流感藥物，分別是神經(jīng)氨酸酶抑制劑和基質(zhì)蛋白2離子通道拮抗劑。隨著抗流感藥物的廣泛使用

3、，這些藥物均出現(xiàn)了不同程度的耐藥。流感病毒耐藥性監(jiān)測(cè)對(duì)制定恰當(dāng)?shù)闹委熀皖A(yù)防方案、規(guī)范抗流感藥物的使用等方面具有重要的意義。2013年中國突然出現(xiàn)的H7N9禽流感給人們帶來極大恐慌，截止2014年第2周實(shí)驗(yàn)室確證的感染人數(shù)達(dá)210人，死亡率達(dá)22％。很多研究表明在出現(xiàn)流感癥狀的48h以內(nèi)使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑比超過48h更加有效。因此，快速和準(zhǔn)確的區(qū)分H7N9禽流感亞型病毒和其它常見的流感病毒對(duì)于臨床治療和流行病學(xué)研究具有重要意義。

4、　　針對(duì)上述原因，本文旨在研發(fā)三種基因芯片試劑盒用于檢測(cè)主要的蚊媒病毒和寄生蟲、常見的甲型流感病毒奧司他韋和金剛烷胺耐藥、新發(fā)H7N9禽流感及常見的A型和B型流感。為主要的蚊媒病原體、流感病毒的耐藥和分型檢測(cè)提供新的技術(shù)手段，提高軍隊(duì)在熱帶、叢林戰(zhàn)區(qū)應(yīng)對(duì)此類生物戰(zhàn)劑和高發(fā)疾病的應(yīng)急檢測(cè)能力。
　　方法：
　　以實(shí)驗(yàn)室基因芯片試劑盒開發(fā)平臺(tái)為技術(shù)手段，研究的技術(shù)路線主要分為三部分:1.引物探針篩選。通過文獻(xiàn)調(diào)研確定靶病原體和靶

5、基因，設(shè)計(jì)和文獻(xiàn)檢索用于芯片的引物和探針。收集標(biāo)準(zhǔn)病毒株樣本建立質(zhì)粒參考品，無樣本的病原體人工合成制備靶基因質(zhì)粒。制備靈敏度參考品和特異性參考品，完成引物和探針初步篩選。2.實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。重點(diǎn)優(yōu)化多重RT-PCR和多重PCR擴(kuò)增體系及芯片檢測(cè)方法。3.試劑盒性能評(píng)價(jià)。以陽性參考品、陰性參考品評(píng)價(jià)試劑盒的特異性。以靈敏度參考品評(píng)價(jià)試劑盒的靈敏度或采用與其他檢測(cè)方法比較的方法評(píng)價(jià)試劑盒靈敏度。檢測(cè)實(shí)際臨床樣本或病毒樣本評(píng)價(jià)試劑盒的使用效果

6、。
　　結(jié)果：
　　1.主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測(cè)基因芯片的研制:首先，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研確定了檢測(cè)的12種常見蚊媒病毒（登革熱病毒1-4型、日本腦炎病毒、黃熱病病毒、圣路易士腦炎病毒、西尼羅河病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、基孔肯亞病毒）和7種常見蚊媒寄生蟲（間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲、班氏絲蟲、馬來絲蟲、帝汶絲蟲）。構(gòu)建完成了12種病毒和7種寄生蟲的質(zhì)粒參考品。以病毒質(zhì)粒參考品為

7、模板，制備了10種病毒的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為靈敏度參考品。構(gòu)建了MS2噬菌體蛋白包裹的病毒樣顆粒作為病毒芯片的RNA陽性參考品。其次，對(duì)芯片的引物探針進(jìn)行了篩選。篩選出19條引物和21條芯片探針用于擴(kuò)增和檢測(cè)蚊媒病毒和寄生蟲。然后，對(duì)芯片的反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，將蚊媒病毒芯片分為兩組多重RT-PCR擴(kuò)增體系，寄生蟲為一組多重PCR擴(kuò)增體系，優(yōu)化了引物配比以保證各個(gè)靶基因都能夠良好的擴(kuò)增。建立并優(yōu)化了芯片化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。最后，對(duì)芯片的性能進(jìn)

8、行了評(píng)價(jià)。特異性評(píng)價(jià)結(jié)果表明芯片可以良好區(qū)分上述12種病毒和6種寄生蟲（馬來絲蟲和帝汶絲蟲之間無法分型）。靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，病毒芯片的檢測(cè)限為102-103copies/反應(yīng);寄生蟲芯片的檢測(cè)限為101-103copies/反應(yīng)。中國疾病預(yù)防控制中心提供的JEV病毒樣本檢測(cè)結(jié)果表明，JEV病毒樣本的檢測(cè)限為100.8-101.8PFU/ml。
　　2.主要甲型流感病毒耐藥分析可視化基因芯片的研制:建立了一種同時(shí)檢測(cè)甲型H1N1、

9、季節(jié)性H1N1、H3N2三種常見流感亞型奧司他韋耐藥相關(guān)的NA基因H275Y(N1型流感)和E119V(N2型流感)突變，金剛烷胺耐藥相關(guān)的M2基因V27A和S31N突變的高通量方法。首先，構(gòu)建了野生型和耐藥型質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板制備了野生型和耐藥型體外轉(zhuǎn)錄RNA。其次，篩選出檢測(cè)金剛烷胺耐藥的2對(duì)引物和23條芯片探針，與文獻(xiàn)中檢測(cè)奧司他韋耐藥的引物和探針組合成完整的芯片體系。第三，優(yōu)化了兩組多重RT-PCR體系和量子點(diǎn)催化銀沉積的可視化

10、檢測(cè)方法。第四，對(duì)芯片的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。陽性病毒樣本和陰性病毒參考品檢測(cè)驗(yàn)證了芯片流感分型特異性，野生和耐藥的體外轉(zhuǎn)錄RNA驗(yàn)證了芯片耐藥檢測(cè)的特異性。靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果表明芯片的靈敏度與流感病毒熒光定量RT-PCR試劑盒靈敏度相當(dāng)。對(duì)PH1N1野生和耐藥混合模板檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)?shù)涂截惸０暹_(dá)到1％-5％時(shí)芯片即可檢出。最后，檢測(cè)了307例臨床咽拭子樣本。其中的全部281例陽性樣本均攜帶金剛烷胺耐藥突變(S31N)，全部5例季節(jié)性H1N1同時(shí)

11、攜帶奧司他韋耐藥突變(H275Y)，H3N2和甲型H1N1未發(fā)現(xiàn)奧司他韋耐藥突變。芯片與測(cè)序結(jié)果的符合率達(dá)到98.8％。
　　3.新發(fā)H7N9禽流感病毒甄別檢測(cè)基因芯片的研制:用于分型檢測(cè)H7N9禽流感、H5N1禽流感、甲型H1N1、季節(jié)性H1N1、季節(jié)性H3N2五種A型流感，并能夠通用的檢測(cè)A型和B型流感。首先，設(shè)計(jì)并篩選了H7N9禽流感HA和NA基因2對(duì)引物和3條探針以及1組人RNase P內(nèi)標(biāo)引物探針。其次，將篩選出的H7N

12、9引物探針與文獻(xiàn)中其他亞型引物探針進(jìn)行組合。優(yōu)化了三組多重RT-PCR體系，建立并優(yōu)化了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。第三，40例流感病毒培養(yǎng)樣本檢測(cè)結(jié)果證明了芯片對(duì)于上述流感亞型分型性能良好，靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，芯片的靈敏度與流感熒光定量RT-PCR試劑的靈敏度相當(dāng)或低10倍。最后，應(yīng)用芯片檢測(cè)了66例臨床樣本驗(yàn)證了芯片的實(shí)用性。
　　結(jié)論：
　　研發(fā)了三種分別用于檢測(cè)常見的蚊媒病毒和寄生蟲、常見的甲型流感病毒奧司他韋和金剛烷胺耐藥、