傳染性病毒聯(lián)合檢測基因芯片的研究制備.pdf

1、流行性感冒是一種由流感病毒引起的上呼吸道傳染病。流感極易在人群中傳播，歷史上幾次流感的大流行都造成成千上萬人死亡。流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型流感又包含15個血凝素(hemagglutinin，HA)亞型和9個神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)亞型，其中常引起人群發(fā)病的是甲型流感病毒中的H1N1和H3N2。 登革病毒(denguevirus，DV)感染是一種重要的蚊媒傳染病，主要流行于熱帶、亞熱

2、帶地區(qū)。DV包括4個不同血清型，即登革1、2、3、4型病毒(DV1～4型)。受登革病毒感染后初期癥狀可能類似一般感冒，少數(shù)病例會發(fā)展到嚴(yán)重可致死的登革出血熱(Denguehaemorrhagicfever,DHF)／登革休克綜合征(dengueshocksyndlone,DSS)。全球每年有大約0.8～1億登革熱和25～50萬登革出血熱或登革休克綜合征患者。 乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis，J

3、EV)引起，經(jīng)蚊蟲叮咬傳播的一種傳染性疾病，該病能引起嚴(yán)重的腦炎，往往會導(dǎo)致永久性大腦損傷，死亡率高。全球每年大概有16000例以上的乙型腦炎患者，約5000例的死亡報告，并且30％-50％的病愈患者會有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。該病主要分布于亞洲地區(qū)。 黃熱病曾在南美洲、非洲等熱帶地區(qū)引起大范圍的流行，該疾病是由黃熱病毒(yellowfevervirus，YFV)引起，其臨床表現(xiàn)差別懸殊，輕型僅為自限性發(fā)熱，重型可發(fā)展至嚴(yán)重的

4、肝炎和出血熱。每年估計有200，000例黃熱病患者(30，000例死亡)。 上述傳染性病毒在感染早期通常臨床癥狀相似，難以實現(xiàn)早期臨床診斷，并且大多數(shù)的傳染性病毒感染目前尚無有效手段阻止或延緩病程發(fā)展，因此早期實驗室檢測對于迅速做出診斷，確立正確及時的治療方案、避免誤診、貽誤病程和控制疫情有重要意義。 目前針對病毒感染的實驗室檢測往往依賴于病毒分離培養(yǎng)、核酸檢測(如PCR)和血清學(xué)檢測(如ELISA)等方法。多數(shù)病毒檢測

5、方法主要用于單一致病因子的鑒定，并且都存在不足之處?；蛐酒夹g(shù)代表著分子技術(shù)領(lǐng)域的最新發(fā)展，具有快速診斷和敏感的核酸分析能力。該技術(shù)在微生物分析、病原體檢測、基礎(chǔ)和應(yīng)用環(huán)境科學(xué)的監(jiān)控等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究首先運用生物信息學(xué)軟件如BLAST、Oligo6.0、DNAClub，篩選出特異性高、長度一致、Tm值相近的寡核苷酸探針，經(jīng)BLAST比對排除非特異性探針，分別針對H1N1、H3N2、DV1、DV2、DV3、DV

6、4、JEV和YFV設(shè)計并合成了62條寡核苷酸探針，用于點樣制備寡核苷酸芯片。采用K562細胞、乙型肝炎病毒質(zhì)粒、丙型肝炎病毒質(zhì)粒和丁型肝炎病毒質(zhì)粒作為陰性對照樣品。從省疾病預(yù)防控制中心取回的甲型流感H1N1、H3N2、DV1～4病毒株中提取的RNA樣品和克隆有JEV、YFV基因的質(zhì)粒樣品用于驗證探針。采用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)進行全基因組擴增標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物純化后與芯片進行雜交，并根據(jù)雜交結(jié)果篩選出與相應(yīng)病毒樣品的雜交信噪比高于2.5，且與其

7、它病毒樣品無非特異性雜交信號的寡核苷酸探針，得到22條高靈敏性、高特異性的寡核苷酸探針。 本課題通過實驗室研究，得到以下實驗結(jié)果： 1.通過實驗排除了非特異性雜交的探針以及存在空間位阻的探針，最終確定從62條探針中，選用了22條探針進行臨床樣品驗證。 2.優(yōu)化寡核苷酸芯片實驗條件。結(jié)果表明，探針濃度調(diào)整為1μg/μL。雜交溫度42℃，雜交時間4h，雜交液含50％甲酰胺，10×SSC，0.2％SDS為寡核苷酸芯片最

8、適的實驗條件。 3實驗中新樣品加接頭后再次引入限制件酶切，該步驟能有效的去除可能的污染片段，而新加上接頭的樣品片段由于有甲基化保護，不會被酶切，從而可以避免實驗過程中假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。 4.為了監(jiān)測芯片檢測的過程中是否存在人為的操作失誤以及降低芯片檢測的假陽性率和假陰性率，研究中芯片陣列設(shè)計引入2條GFP寡核苷酸探針作為陽性外對照，實驗中將由重組載體上獲得的GFP基因的RNA、DNA片段和各病毒樣品混合后分別用限制性顯示

9、技術(shù)擴增標(biāo)記，將標(biāo)記的樣品與芯片雜交，完成芯片的掃描及結(jié)果分析。結(jié)果表明，陣列設(shè)計中引入陽性外對照探針能為基因芯片的檢測過程提供有效的質(zhì)控。 5.臨床樣品的檢驗研究。研究中應(yīng)用寡核苷酸芯片對41例臨床樣品和疫苗株樣品(JEV、YFV)進行了檢測。其方法是：從樣品中抽提出病毒RNA，與GFP基因的RNA樣品混合后，逆轉(zhuǎn)錄并用限制性顯示標(biāo)記技術(shù)使樣品標(biāo)上熒光物質(zhì)，與包含有實驗中篩選出的22條高靈敏性、高特異性的寡核苷酸探針及2條GF

10、P陽性外對照探針的芯片進行雜交，芯片洗脫、掃描后采用GenePixPro6.0軟件進行結(jié)果分析。同時實驗中設(shè)計了多對引物，通過多重逆轉(zhuǎn)錄PCR臨床樣品進行鑒定，并與芯片的檢測結(jié)果相對照。雜交結(jié)果表明，芯片的特異性和靈敏度均較高，在這41例臨床樣品中，甲1型流感有6例，甲3型流感有2例，DV1有3例，DV2、DV3和DV4各1例，與多重逆轉(zhuǎn)錄PCR_的實驗結(jié)果相一致。 綜上所述，研究中我們將限制性顯示PCR與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，選