食源性沙門氏菌的PCR快速檢測技術研究.pdf

1、沙門氏菌是一種廣泛分布于自然界的危害極大的腸道致病菌，人們會因為直接接觸或食用被污染的食物而感染，并導致腹瀉或系統(tǒng)性疾病，在世界各國的各類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首。目前，檢測方法在控制食物污染和傳播方面仍占有重要地位，然而現(xiàn)有的檢測方法耗時較長或者檢測靈敏度較低等不能滿足及時準確評價食品中微生物安全性的需求，因此，有必要建立快速靈敏的檢測方法為保障食品安全提供有效的檢測工具。本研究通過優(yōu)化建立了以DNA為基礎的熒

2、光定量PCR檢測方法，并進行特異性、靈敏度、重復性等檢測以及食品添加實驗分析方法的適用性和可靠性。同時，研究了不同熱處理對沙門氏菌DNA降解的影響，以及死亡菌體對熒光定量PCR檢測結果的影響。最后優(yōu)化建立了基于區(qū)分死活菌體的逆轉錄熒光定量PCR檢測條件，并驗證死亡菌體對檢測結果的影響。
　　 研究結果表明：(1)優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測條件為：95℃/30 s；然后95℃/5 s，64℃/34 s，此步驟為40個循環(huán)；最后添加

3、融解曲線分析。反應體系總量為20μl，其中上下游引物(1μM)的添加量為2μl。建立的熒光定量PCR方法特異性強，重復性良好，靈敏度高而且不需要前增菌大大縮短了檢測時間，整個實驗操作過程可在4 h內完成。將此方法應用于人工污染食品中沙門氏菌的檢測，結果表明生鮮豬肉、調理雞肉和鮮牛奶樣品中沙門氏菌的檢測靈敏度分別為1.9×102cfu/g、4.5×102cfu/g和1.5×102cfu/ml。通過與微生物傳統(tǒng)計數(shù)方法的檢測結果進行比較，結

4、果顯示不論在定性還是定量方面與傳統(tǒng)方法的符合率為100％，可用于食品中沙門氏菌的定量檢測。(2)食品加工和消費中常見的熱處理65℃/20 min、85℃/30 min、沸水浴/3 min和121℃/15 min能完全殺死菌液中沙門氏菌：加熱溫度越高對基因組DNA的破壞性越大，但是加熱并不能使細菌DNA完全降解消亡，經(jīng)不同溫度和時間加熱處理后，目的基因片段仍不同程度地殘存在死亡的細胞當中，并且消亡速度非常緩慢。(3)熱致死沙門氏菌中殘存的

5、基因組DNA或DNA片段對熒光定量PCR檢測結果影響較大，對人體健康沒有威脅的死亡菌體樣品經(jīng)檢測結果為陽性，表明以DNA為基礎的熒光定量PCR不能有效地區(qū)別死活菌，此方法并不適用于含有熱致死菌體的樣品例如加工肉制品、即食食品中沙門氏菌的檢測，而較適用于生鮮食品的檢測。(4)優(yōu)化后的逆轉錄熒光定量PCR反應條件為：42℃/5 min，95℃/5 s；然后95℃/5 s，67℃/34 s，此步驟為40個循環(huán)；最后添加融解曲線分析。反應體系總

6、量為25μl，其中上下游引物(1μM)添加量分別為4μl。建立的逆轉錄熒光定量PCR不需前增菌處理，整個檢測過程在4h內即可完成，明顯地縮短了檢測時間。另外，生鮮豬肉、調理雞肉和鮮牛奶樣品中沙門氏菌的靈敏度分別為1.9×102cfu/g、4.5×103cfu/g和1.5×103cfu/ml比熒光定量PCR的靈敏度低。比較該方法與熒光定量PCR的定量結果發(fā)現(xiàn)，定量檢測不如熒光定量PCR，但是它的最大優(yōu)點是可以區(qū)分死活菌彌補了熒光定量PCR