多重PCR檢測(cè)食品中志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌方法的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)食品安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn),在各種食品安全事件中,病原菌的污染是引起食源性疾病的主要因素之一,快速檢測(cè)食品中病原菌是及時(shí)有效預(yù)防病原菌傳播及食品中毒的重要前提。常見(jiàn)的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單核增生李斯特氏菌、致瀉性大腸桿菌、變形桿菌等。目前,食品中致病菌的檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法,其操作繁瑣,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),通常需要4～7d才能完成,且靈敏度較低。近年來(lái),PCR針對(duì)某一

2、種或一類致病菌的檢驗(yàn)方法被建立起來(lái),但是一旦檢測(cè)的方向有誤就會(huì)造成時(shí)間和藥品的浪費(fèi),急需建立一種快速有效且通量較高的檢測(cè)方法。因此,多重PCR作為一種可同時(shí)檢測(cè)多種病原菌的方法發(fā)展十分迅速。
　　 本研究建立了志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌的多重PCR技術(shù),根據(jù)志賀氏菌的侵染性質(zhì)粒抗原H基因ipaH、沙門氏菌的侵染性質(zhì)粒抗原B基因ipaB、變形桿菌的atpD基因設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物,進(jìn)行多重PCR反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種食源性致病菌的同

3、時(shí)檢測(cè)。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)多重:PCR反應(yīng)體系中引物添加量、鎂離子添加量、dNTPmixture添加量及退火溫度和Taq酶的添加量等影響要素進(jìn)行優(yōu)化,確定了適宜的多重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序,其反應(yīng)體系為:10×Buffer2.5μL,50mMMg2+1μL,2.5mMdNTP1μL,10μM的上下游引物各1μL,5U/μLTaq酶0.3μL,雙蒸水補(bǔ)足至25μL;多重PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,56℃退火45s

4、,72℃延伸45s,30個(gè)循環(huán),72℃終延伸10min,反應(yīng)產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對(duì)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了克隆和DNA測(cè)序,登錄Genebank將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上blast,從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　 本研究共檢測(cè)了15株菌,2株志賀氏菌、4株沙門氏菌、2株變形桿菌均為陽(yáng)性結(jié)果;7株其它腸桿菌均為陰性結(jié)果,從而驗(yàn)證多重PCR引物特異性。將三種致病菌混合,分別加入1對(duì),2

5、對(duì)和3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,均能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出結(jié)果,因此該多重PCR反應(yīng)特異性較強(qiáng)。
　　 本方法對(duì)三種食源性致病菌的純菌培養(yǎng)物單菌檢測(cè)靈敏度為志賀氏菌102CFU/ml、沙門氏菌101CFU/ml、變形桿菌102CFU/ml;同時(shí)檢測(cè)三種食源性致病菌的靈敏度為志賀氏菌102CFU/ml、沙門氏菌102CFU/ml、變形桿菌102CFU/ml。
　　 本方法使用試劑盒處理樣品,再通過(guò)多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)人工污染豬肉中三種致病菌