生產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選及其相關(guān)特性研究.pdf

1、乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)通常是指能夠利用可溶性碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽(yáng)性菌的通稱。長(zhǎng)期以來(lái)，乳酸菌被認(rèn)為是安全(GenerallyRecongnized as Safe，GRAS)菌株，應(yīng)用于食品發(fā)酵，改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)與風(fēng)味。目前，酸奶中應(yīng)用較為廣泛的菌株有德氏乳桿菌及嗜熱鏈球菌。其中，嗜熱鏈球菌還與其它乳酸菌共同發(fā)酵生產(chǎn)硬質(zhì)奶酪等。
　　γ--氨基丁酸（γ-aminobutyric aci

2、d，GABA）是天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，2009年衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)過(guò)了GABA作為新資源食品，被廣泛的應(yīng)用于食品加工業(yè)。GABA還是一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)人體有很多積極的生理作用，如降血壓，緩解緊張，促進(jìn)睡眠及治療癲癇等。谷氨酸脫羧酶是合成γ-氨基丁酸的關(guān)鍵酶，在眾多生物體中存在。由于乳酸菌的安全性，通過(guò)乳酸菌生產(chǎn)GABA具有良好的前景。本文對(duì)產(chǎn)生GABA的乳酸菌進(jìn)行了篩選并對(duì)生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶進(jìn)行了克隆和異源表達(dá)，獲得

3、了富含GABA的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品，具體工作和取得成果如下:
　　1、生產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選
　　利川紙層析法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的14株乳桿菌、1株嗜熱鏈球菌和2株乳酸乳球菌產(chǎn)生GABA能力進(jìn)行初篩，結(jié)果表明嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌及德式乳桿菌保加利亞亞種均能夠產(chǎn)生GABA;利用粗酶液測(cè)定谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD)酶活進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)這3株菌中嗜熱鏈球菌酶活最高。接著又對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的28株嗜熱

4、鏈球菌產(chǎn)生GABA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除Streptococcusthermphilus SDMCC050200外，其他27株均能產(chǎn)生GABA，其中SthermphilusSDMCC050201產(chǎn)量最高。利用PCR方法，對(duì)合成GABA的關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶的基因gadB進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28株菌中均編碼有谷氨酸脫羧酶基因gadB。測(cè)序及序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不產(chǎn)生GABA的菌株SDMCC050200其谷氨酸脫羧酶在171位殘基發(fā)生廠突變，山天冬氨酸突變?yōu)楦?/p>

5、氨酸。
　　2、谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)
　　分別克隆S thermphilus SDMCC050201和SDMCC050200的gadB在Escherichia coli中表達(dá)，表達(dá)蛋白經(jīng)Ni+柱純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的2種蛋白分子量大小相同，但是自來(lái)于SDMCC050200異源蛋白沒有酶活。本章對(duì)來(lái)自于S thermphilus SDMCC050201的GAD酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，該酶大小為45kDa左右，與理論預(yù)測(cè)的分子量大

6、小一致。最適溫度為40℃，最適pH為4.0。在低pH，且低于50℃時(shí)保存酶，可以保持酶的較高活性。Ag+，Cu2+，SDS對(duì)酶的活性影響較大，在低濃度時(shí)能抑制酶的活性，而Ba2+、Co2+等能夠促進(jìn)酶的活力。酶反應(yīng)常數(shù)Km為11.27mmol·L-1、Vmax為16.64mmol·L-1·h-1。
　　3、谷氨酸脫羧酶的功能分析
　　利用同源雙交換對(duì)S.thermphilus SDMCC050201的gadB基因進(jìn)行了敲除并

7、測(cè)序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在gadB基因的上游與報(bào)道的Sthermphilus ND03不同，重新設(shè)計(jì)同源臂進(jìn)行敲除，得到的敲除突變株株除gadB結(jié)構(gòu)基因外，在其上游多敲掉200bp左右，由于gadB上游發(fā)現(xiàn)多敲除的部分高度疑似為gadB啟動(dòng)子，因此以得到的該敲除株進(jìn)行后續(xù)工作。與野生株株相比，突變株生長(zhǎng)更有優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在生長(zhǎng)速度快，穩(wěn)定期的生物量高，且外源添加MSG(Sodium glutamatehydrate，MSG)時(shí)，菌株生長(zhǎng)更好，表

8、明菌株生長(zhǎng)與gadB無(wú)關(guān)。在酸脅迫條件下，我們發(fā)現(xiàn)在外源添加MSG時(shí)，野生株存活率增加，當(dāng)pH=3時(shí)，gadB能夠賦予菌株抗酸脅迫能力;而pH=4時(shí)，gadB對(duì)菌株的保護(hù)能力不明顯。
　　4、GABA產(chǎn)生條件的優(yōu)化
　　利用高壓液相色譜法(HPLC)對(duì)GABA進(jìn)行定量檢測(cè)，由于GABA本身沒有發(fā)光基團(tuán)，采用丹磺酰氯衍生的方法，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)具有很好的線性關(guān)系。對(duì)于在GMRS培養(yǎng)基中的發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果

9、SDMCC050201得到GABA的含量為4.697+0.183 g/L;當(dāng)替換GMRS碳源為乳糖時(shí)，GABA的產(chǎn)量為2.937±0.079g/L;當(dāng)替換GMRS碳源碳源為蔗糖時(shí)，GABA的產(chǎn)量較高4.379+0.008g/L。將Sthermphilus SDMCC050201單獨(dú)接入滅菌牛奶或S thermphilus SDMCC050201與Lb.delbrueckii subsp.burgaricus ATCC11842共同接入滅