枯草芽孢桿菌戊糖與半纖維素的高效利用及乙偶姻的生產(chǎn).pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中含量最多的生物質(zhì)，其中所含有的纖維素與半纖維素占其總質(zhì)量的75％左右，有效利用這部分天然資源將有利于降低發(fā)酵工業(yè)的成本。
　　半纖維素中的主要組分為木糖，而枯草芽孢桿菌并不能直接利用木糖，本研究采用進(jìn)化工程的方法獲得一株能夠有效利用木糖快速生長的枯草芽孢桿菌E72，其利用木糖生長時的最大比生長速率為0.445h-1，高于目前所報道的結(jié)果，進(jìn)一步通過全基因組測序及反向代謝工程的方法發(fā)現(xiàn)三個對利用木糖有重要影響的基

2、因突變。其中araR基因的突變使枯草芽孢桿菌可以直接利用木糖，sinR基因的突變將菌體利用木糖生長時的比生長速率提高至0.437 h-1，而comP基因的突變通過延長菌體生長的指數(shù)生長期進(jìn)一步改善了菌株利用木糖的能力。含這三個突變的重構(gòu)菌株168ARSRCP，與進(jìn)化菌株E72相比，維持較好的木糖利用及生長能力，且具有延滯期較短及易于進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)。
　　通過敲除acoA及bdhA基因，168ARSRCPΔacoAΔbdhA菌株

3、可直接利用木糖有效地生產(chǎn)乙偶姻，進(jìn)一步組成型過表達(dá)araE基因及大腸桿菌xylAB操縱子，獲得的菌株168ARSRCPΔacoAΔbdhA（pHP3-PA-PAB），該菌株可以同時利用木糖、阿拉伯糖及葡萄糖生產(chǎn)乙偶姻。分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果表明，該菌株能夠72小時內(nèi)利用約200 g/l混合糖生產(chǎn)57.4 g/l乙偶姻。
　　微生物直接利用纖維素與半纖維素進(jìn)行一體化生物加工生產(chǎn)大宗化學(xué)品是一種經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方式，該過程存在的主要問題之一是包括

4、枯草芽孢桿菌在內(nèi)的許多微生物并不能產(chǎn)生足夠的纖維素酶與半纖維素酶使之能有效地分解并直接利用纖維素與半纖維素。通過采用過表達(dá)木聚糖酶的方式成功改善了枯草芽孢桿菌直接利用木聚糖生長的能力，并且過表達(dá)了木聚糖酶的工程菌株168ARSRCPΔacoAΔbdhA（p9CR-P43-xynA）獲得了利用木聚糖生產(chǎn)乙偶姻的能力，實(shí)現(xiàn)了以木聚糖為底物一體化生產(chǎn)乙偶姻的過程。此外從轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白運(yùn)輸?shù)榷鄠€方面優(yōu)化了纖維素酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。首先基

5、于計(jì)算機(jī)預(yù)測對適用于纖維素酶EglS的信號肽進(jìn)行了篩選，獲得了能夠提高纖維素酶分泌能力的信號肽SywmC，使得胞外纖維素酶活提高了22%。我們又對枯草芽孢桿菌的啟動子進(jìn)行了篩選并發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)啟動子PcspD，該啟動子的表達(dá)效果較枯草芽孢桿菌常用的強(qiáng)啟動子P43提高了58%。之后通過在eglS基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)前加入mRNA的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)將胞外的纖維素酶活提高了35%，最后通過采用高拷貝質(zhì)粒進(jìn)一步提高了纖維素酶的酶活，使枯草芽孢桿菌能夠直接利用