枯草芽孢桿菌轉化方法的建立和Pglv高效表達載體的構建.pdf

1、大腸桿菌表達系統(tǒng)，雖然它的載體、受體系統(tǒng)已經(jīng)比較成熟完善，但其表達產(chǎn)物容易形成包涵體，分泌效率低，此外大腸桿菌是一種潛在病原菌，生長過程中不斷釋放脂多糖熱原物質等內毒素，目前已被限制用于表達生產(chǎn)醫(yī)藥和食品。
　　枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為表達系統(tǒng)具有無致病性，不產(chǎn)生內毒素，嚴格生長在有氧條件下，容易將表達蛋白分泌到培養(yǎng)基中。此外芽孢桿菌的發(fā)酵技術已經(jīng)非常成熟，如α-淀粉酶、蛋白酶等商品化的酶都是利用枯草

2、芽孢桿菌生產(chǎn)的。
　　本實驗著重構建可調控的枯草芽孢桿菌高效表達載體。從篩選強麥芽糖啟動子出發(fā)，并成功構建了麥芽糖誘導型表達載體Pglv-pHCMC04，并通過轉化方法比較、優(yōu)化得出最適轉化枯草芽孢桿菌的方法:低鹽環(huán)境饑餓法，即S法，轉化效率達到1.2×104 CFU/μgDNA;后為了研究所構建的表達載體特性，本實驗從大小基因及信號肽方面著手，通過連接紅色熒光蛋白、帶有地衣芽孢桿菌信號肽的高溫淀粉酶基因、去掉信號肽的地衣芽孢桿菌

3、高溫淀粉酶基因、帶有灰色鏈霉菌信號肽的淀粉酶基因等一系列報告基因對其特性研究得出:小基因在枯草中表達的可能性及大基因在枯草中表達需要帶信號肽，且枯草在分泌胞外蛋白時對不同屬的信號肽具有識別作用。然后對連接有地衣芽孢桿菌信號肽的高溫淀粉酶基因進行發(fā)酵條件優(yōu)化，從最適麥芽糖添加量、最適誘導溫度、最適誘導物添加時間、和最適接種量幾方面著手，進行單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，得出了最適的發(fā)酵條件，即:將過夜培養(yǎng)菌株接種2％至OD600達到0.55時添加1