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文檔簡介
1、幾丁質(zhì)及其衍生物經(jīng)幾丁質(zhì)酶降解,產(chǎn)生一些幾丁寡糖,能止血抗凝、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、降低血壓,促進(jìn)有益微生物(如雙歧桿菌)生長;還能激活巨嗜細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生,提高機(jī)體免疫力;另能刺激成纖維細(xì)胞增殖,有利于膠原沉積,與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合,促進(jìn)組織修復(fù)。此外,幾丁寡糖還有抗菌防腐、保水保濕等功效。在醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有廣泛的開發(fā)前景。 本研究的目的是探索利用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌系統(tǒng)來表達(dá)來自于蘇云金芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶基因。本文通過P
2、CR的方法從蘇云金芽孢桿菌的染色體上擴(kuò)增得到幾丁質(zhì)酶基因chiA,通過測序鑒定與報(bào)道的蘇云金芽孢桿菌konkukian亞種的幾丁質(zhì)酶基因的序列完全一致。分別構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-chiA和pHSG-chiA,將它們分別在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達(dá)。通過酶活的測定在兩種重組菌中都檢測到了酶活。同時(shí)對(duì)重組芽孢桿菌所產(chǎn)的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)作了初步的研究。重組酶的最適作用溫度大約在50℃,30℃-60℃為酶的穩(wěn)定溫度范圍,同時(shí)將酶60℃保
3、溫30min,仍然保持約80%的酶活力。最適作用pH約7.0,酶的穩(wěn)定pH范圍為4-8??疾彀l(fā)現(xiàn)pET-28a-chiA在大腸桿菌中穩(wěn)定性較好,而對(duì)于芽孢桿菌表達(dá)載體pHSG-chiA在傳代過程中發(fā)生質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象,無選擇壓力下連續(xù)轉(zhuǎn)接5次,幾乎全部發(fā)生丟失。 對(duì)重組菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步的優(yōu)化,分別考察了碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量以及誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)酶的影響。得到了最終的優(yōu)化培養(yǎng)基,其成分為:幾丁質(zhì)2%,酵母膏2.
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