枯草芽孢桿菌課件

1、枯草芽孢桿菌 Bacillus Subtilis,陳家馨 王玲玲 沈嘉妮,Contents,介紹枯草芽孢桿菌,1,為什么選擇枯草芽孢桿菌,2,建立beadzillus開發(fā)Sporo beads,3,Sporo beads是什么,4,Sporo beads的應(yīng)用,5,目,錄,2,枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌，芽孢桿菌屬的一種。因?yàn)橐自诳莶萁褐蟹敝常匀藗內(nèi)∶莶菅挎邨U菌。革蘭氏陽性菌，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培

2、養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。,3,枯草芽孢桿菌能夠分化成具有不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。最特征的形式是在營養(yǎng)不足的情況下產(chǎn)生的內(nèi)生孢子。在我們的項(xiàng)目中，我們利用了內(nèi)生孢子的生產(chǎn)。因?yàn)樗鼈兪菢O其穩(wěn)定的，孢子是用于功能性融合蛋白的。,枯草芽孢桿菌的生命周期和不同的細(xì)胞階段。,營養(yǎng)周期與大腸桿菌非常相似。然而，在諸如饑餓等壓力源的情況下，細(xì)胞進(jìn)入孢子形成，首先進(jìn)行極細(xì)胞分裂，然后形成內(nèi)生孢子。如

3、果環(huán)境條件再次合適，則孢子會發(fā)芽并重新進(jìn)入營養(yǎng)循環(huán)。,4,枯草芽孢桿菌的自然棲息地是土壤，被迫適應(yīng)許多環(huán)境變化。因此，枯草芽孢桿菌的特征在于快速和狡猾的反射和復(fù)雜的生活方式。由于其天然的能力，它可以占據(jù)外源DNA并將其整合到其基因組中。靈活應(yīng)對環(huán)境，轉(zhuǎn)向營養(yǎng)或避免有毒物質(zhì)，它的活動是借助其鞭毛。如果饑餓，一些細(xì)胞甚至成為食人兄弟姐妹。如果條件對于生存來說太糟糕了， 枯草芽孢桿菌可以形成內(nèi)生孢子。這些是非常休眠和高度穩(wěn)定的階段，耐干燥，紫

4、外線，熱和壓力。一旦這些孢子遇到更好的條件，他們才能再次發(fā)芽。,芽孢桿菌的分化,在枯草芽孢桿菌群落中區(qū)分不同細(xì)胞類型的示意圖,5,,01,易于培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳操作,02,標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)粒原件和相應(yīng)的基因改造方法,03,安全性,模式生物需要滿足的條件,6,迄今為止大部分的合成生物學(xué)操作都是基于大腸桿菌（Escherichia coli）的，大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌具有革蘭氏陰性菌不具有的一些優(yōu)勢，比如：革蘭氏陽性菌有天然的外源基因

5、攝入和整合入基因組的機(jī)制，這種機(jī)制為遺傳操作提供了方便；革蘭氏陽性菌的分泌機(jī)制比較完善，蛋白質(zhì)表達(dá)后可以很好地分泌到細(xì)胞外，而這正是革蘭氏陰性菌在異源蛋白表達(dá)時面臨的最大問題。,枯草芽孢桿菌革蘭氏陽性菌,7,枯草芽孢桿菌可以復(fù)制大腸桿菌的質(zhì)粒，但是有一種更優(yōu)雅的方式引入外源DNA片段。當(dāng)側(cè)面與枯草芽孢桿菌基因組同源時，將通過在該基因座處的同源重組以高效率整合，隨后用染色體復(fù)制。這導(dǎo)致穩(wěn)定的單拷貝基因組改變，從而避免使用復(fù)制質(zhì)粒發(fā)生的拷貝

6、數(shù)偽影。這種不同的基因操作的方式需要使用整合載體，如通過我們提供B4-22。因此，枯草芽孢桿菌是合成生物學(xué)的理想遺傳平臺。,枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化,8,為了使枯草芽孢桿菌滿足合成生物學(xué)模式生物的要求，核心就是構(gòu)建模塊化的標(biāo)準(zhǔn)。這倒也不是很困難，只需要將大腸桿菌的基因零件標(biāo)準(zhǔn)在枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒上重構(gòu)一下就可以了，枯草芽孢桿菌質(zhì)粒與大腸桿菌不同之處是存在基因組整合位點(diǎn)，將這個位點(diǎn)引入還有零件標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒中，就構(gòu)建成了枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)粒了。

7、之后，慕尼黑大學(xué)構(gòu)建了一系列適用于芽孢桿菌的啟動子，包括常規(guī)表達(dá)的啟動子和誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子。另外，他們還測試了常用的報告基因在這個質(zhì)粒系統(tǒng)中的表達(dá)情況，這些報告基因都針對枯草芽孢桿菌進(jìn)行了密碼子優(yōu)化（Coden Optimization）。這些報告基因包括綠色熒光蛋白、lacZ、熒光素酶。最后，他們測試了常用的蛋白純化標(biāo)簽在枯草芽孢桿菌中的作用。這些工作并沒有什么出彩之處，因?yàn)樗麄兊恼９ぷ髟缫呀?jīng)被驗(yàn)證過。有了標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)粒、啟動子、終止

8、子、報告基因和純化標(biāo)簽，一個合成生物學(xué)模式生物就基本上建立了。,構(gòu)建芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)粒,9,引入枯草芽孢桿菌作為基于BioBrick的合成生物學(xué)的新底盤是此項(xiàng)目的主要目標(biāo)。B4-22核心部分包含以下芽孢桿菌的特定部分Vertors（載體）promoters（啟動子）reporters（通訊員）affinity tags（親和標(biāo)簽） 我們所有的標(biāo)簽都是由GeneArt合成的。我們的親和標(biāo)簽還未驗(yàn)證。,創(chuàng)建B 4 - 22核心部分

9、,10,它們都通過在特定位點(diǎn)的雙重同源重組插入到基因組中。因此，枯草芽孢桿菌中的靶基因被破壞，可以通過特定的檢測來選擇。,載體的整合機(jī)制,11,01,發(fā)光測量,02,β-半乳糖苷酶測定,啟動子的評估方式,12,一，安德森系列啟動子評估它們已經(jīng)在大腸桿菌中被廣泛測量，在枯草芽孢桿菌中測定了11只安德森啟動子，并顯示相對較弱的活性。二，組成型芽孢桿菌啟動子構(gòu)建了三種新的枯草芽孢桿菌啟動子（P liaG，P veg，P lepA）Pli

10、aG該啟動子顯示比Anderson啟動子高得多的活性，但與其他評估的芽孢桿菌啟動子相比仍然相對較弱。Pveg這個推動者是我們評估中最強(qiáng)的。PlepA該啟動子的活性在最強(qiáng)的芽孢桿菌啟動子P veg的活性和弱P liaG之間。P XYL - xylR是從木糖誘導(dǎo)啟動子枯草芽孢桿菌。對于這種啟動子，我們尚未成功克隆到報告載體中以評價活性。,三組啟動子的評估,13,三，誘導(dǎo)性芽胞桿菌啟動子啟動子的最后一組包括來自兩個誘導(dǎo)型啟動子的枯草芽孢桿

11、菌，P LIAI和xylR -P XYL。一種新的抗生素誘導(dǎo)的啟動子P lial其響應(yīng)于干擾細(xì)胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情況下，雙組分系統(tǒng)LiaRS被激活?；罨捻憫?yīng)調(diào)節(jié)劑LiaR與啟動子的操縱子結(jié)合并誘導(dǎo)ia基因座的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)啟動子啟動時，表達(dá)了兩種蛋白質(zhì)LiaI和LiaH。該啟動子的主要優(yōu)點(diǎn)是在不存在誘導(dǎo)物及其高動態(tài)范圍的情況下具有非常低的基礎(chǔ)活性。用不同濃度的桿菌肽測量誘導(dǎo)，證明在大范圍的啟動子活性中具有濃度依賴性反應(yīng)

12、。,,14,螢火蟲螢光素酶是迄今為止最常用的生物發(fā)光通訊員。天然螢火蟲熒光素酶作為遺傳報告基因的普及是由于酶測定的靈敏度和方便性以及蛋白質(zhì)合成與酶活性的緊密耦合。由luc基因編碼的螢火蟲熒光素酶是不需要任何翻譯后修飾的單體; 它可以作為成熟酶直接在其mRNA翻譯中獲得。從核糖體釋放后立即獲得催化能力。此外，熒光素酶在細(xì)胞中的半衰期非常短（約3小時）。綜合起來，這些性質(zhì)使熒光素酶成為一個非常敏感的通訊員，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他常用的通訊員。,芽孢桿

13、菌通訊員的選擇,15,芽孢是細(xì)菌在逆境中形成的一種致密結(jié)構(gòu)，可以抵抗高低溫、缺氧、缺水等一系列不良環(huán)境，又可以在良好的環(huán)境中重新萌發(fā)為完整的菌體。由于芽孢超強(qiáng)的穩(wěn)定性，有很多潛在的應(yīng)用可以被開發(fā)，比如用來作為蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)的呈遞裝置應(yīng)用在過濾柱中，應(yīng)用在很多需要進(jìn)行“過濾”的領(lǐng)域，過濾其實(shí)是個挺復(fù)雜的事情，并不只是我們?nèi)粘Ｉ钪羞^濾雜質(zhì)這么簡單。舉個例子，海水淡化其實(shí)主要就是過濾海水中的陽離子，非常困難的。另外，由于枯草芽孢桿菌本

14、來的生活環(huán)境是在土壤中，它必須時刻準(zhǔn)備應(yīng)對環(huán)境的變化，于是枯草芽孢桿菌進(jìn)化出了一種分化機(jī)制，可以根據(jù)外界環(huán)境分化為不同的性狀，這就為潛在的多種應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。,枯草芽孢桿菌會形成芽孢,16,,我們選擇使用枯草芽孢桿菌來設(shè)計新的視野，并為這種模型生物提供工具，用于大腸桿菌的iGEM世界。因此，我們在BioBrick標(biāo)準(zhǔn)中創(chuàng)建了由定義的啟動子以及報告基因，表達(dá)和空載體組成的芽孢桿菌 B io B rick B ox（B 4—22）。枯草芽孢

15、桿菌天然產(chǎn)生耐應(yīng)力的內(nèi)生孢子，其可以根據(jù)合適的環(huán)境條件發(fā)芽。為了突出使用這種獨(dú)特的功能，我們開發(fā)Sporo beads。這些是表面融合蛋白的孢子。我們將GFP（綠色熒光蛋白）融合到最外層。擴(kuò)大這個想法，我們設(shè)計了一個孢粉矢量可以輕松地創(chuàng)建任何孢粉珠。為了保證孢粉珠的安全，我們通過敲除基因參與防止發(fā)芽，并制定了自殺開關(guān)在發(fā)芽的情況下接通。隨著項(xiàng)目Bead zillus，我們的團(tuán)隊(duì)展示了枯草芽孢桿菌的強(qiáng)大性質(zhì)。,bead zillus：為基

16、本生物磚枯草芽孢桿菌和孢子的蛋白質(zhì)展示的平臺,17,實(shí)驗(yàn)中過濾器的問題,過濾器問題過濾器廣泛應(yīng)用于日常生活和實(shí)驗(yàn)室。過濾器，例如用于從飲用水和管道系統(tǒng)中去除鈣和其他污染物的Brita過濾器是豐富的。在實(shí)驗(yàn)室中，過濾器（通常稱為柱）用于DNA /蛋白質(zhì)純化和蛋白質(zhì)表征。這種過濾器通常由填充有某種類型的矩陣的盒組成。為了使表面最小化，微珠通常用于所有類型的過濾器。這些珠具有特定的尺寸，例如可用于在其表面上顯示蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)與珠子的偶聯(lián)是基于

17、親和力結(jié)合。例如可用于結(jié)合含有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的Ni-NTA樹脂（或珠粒）。如果蛋白質(zhì)以這種方式結(jié)合到珠粒上，則其特征然后確定這種負(fù)載蛋白質(zhì)的珠粒的功能特性。 這樣的珠通常是相當(dāng)昂貴的，蛋白質(zhì)與珠子的偶聯(lián)是費(fèi)力的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)必須被表達(dá)，結(jié)合到珠子上然后洗滌。為了解決這個問題，我們已經(jīng)開發(fā)出在我們的項(xiàng)目中的合成生物學(xué)的解決方案bead zillus，其中生物珠顯示所選擇的蛋白質(zhì)。我們稱這些生物珠孢粉珠。,18,,孢粉珠是以可以用作個體蛋

18、白質(zhì)顯示的平臺的方式修飾的枯草芽孢桿菌孢子。該模塊的目的是創(chuàng)建在其表面上顯示融合蛋白的這些孢子。有幾種不同的蛋白質(zhì)形成枯草芽孢桿菌孢子的孢子層。最外層，即所謂的孢子，由兩種蛋白質(zhì)CotZ和CgeA組成。這就是為什么我們用它們來創(chuàng)建我們要表達(dá)功能融合蛋白孢粉珠。,孢粉珠是什么,19,基因敲除我們選擇了重要的發(fā)芽基因并將其敲除。隨后，我們將單個突變體組合成四倍體突變體，并成功地防止了萌發(fā)。自殺開關(guān)在發(fā)芽基因敲除失敗的情況下，我們發(fā)明了

19、自殺開關(guān)。如果孢子仍然發(fā)芽，毒素的產(chǎn)生將導(dǎo)致立即的細(xì)胞死亡。,保證孢粉珠的安全,20,我們關(guān)于如何防止發(fā)芽發(fā)生的想法是敲除編碼發(fā)芽過程中涉及的功能的基因。有大量的基因在萌發(fā)中發(fā)揮作用，但我們的目標(biāo)是選擇一些非常重要的基因敲除?；谒说难芯浚覀冞x擇的基因是cwlJ， sleB， cwlB， gerD和 cwlD。顯示：cwlJ 和sleB：一起敲除時，發(fā)芽頻率降低5個數(shù)量級。兩種基因都代表了在發(fā)芽過程中有活性的溶酶。ger

20、D 和 cwlB：一起敲除時，發(fā)芽頻率降低5個數(shù)量級。該 GERD產(chǎn)品起著營養(yǎng)發(fā)芽未知的作用; cwlB的產(chǎn)物在細(xì)胞壁周轉(zhuǎn)和細(xì)胞裂解中起作用。注：在多次嘗試后淘汰 cwlB，并產(chǎn)生以非常緩慢的速度生長的細(xì)胞無法生長或細(xì)胞，我們決定淘汰 cwlB不妥當(dāng)生產(chǎn)的孢粉珠，因?yàn)檫@將延遲在所有實(shí)驗(yàn)發(fā)芽停止模塊。cwlD：當(dāng)被淘汰時，發(fā)芽率為0.003至0.05％。該基因編碼由發(fā)芽特異性皮質(zhì)裂解酶切割的識別組分。通過敲除所有這五個基因，我們的目標(biāo)

21、是產(chǎn)生 枯草芽孢桿菌 菌株，其產(chǎn)生完全不能發(fā)芽的孢子。在孢子破壞過程中，發(fā)芽停止。沒有裂解酶分解外套，孢子應(yīng)該不能超過營養(yǎng)階段。,基因敲除,21,作為一個備份計劃，以使我們的孢粉珠更安全，我們開發(fā)了自殺開關(guān)。在孢子發(fā)芽的情況下，由于降解或它們的外涂層，例如，通過高壓的破壞，自殺開關(guān)將被接通。我們利用替代和異源σ因子和目標(biāo)啟動子。兩者都是不存在于枯草芽孢桿菌，并因此不被任何其他因數(shù)σ識別枯草芽孢桿菌。替代σ因子ecf41 比里aa

22、1-204，其從派生地衣芽孢桿菌組成的截短的版本“ON”是合成鏈接到二分之一的σ ?調(diào)控的啟動子強(qiáng)烈響應(yīng)或P SSPK弱響應(yīng)。σ G ^是在forespore激活最后σ因子。因此，Ecf41 Bli aa1-204生產(chǎn)相當(dāng)晚，只在前景中。Ecf41 Bli aa1-204然后激活其獨(dú)特的目標(biāo)啟動子P ydfG。該啟動子與MazF融合。因此，P ydfG的激活導(dǎo)致MazF（一種來自大腸桿菌降解mRNA 的細(xì)菌毒素）的表達(dá)。所產(chǎn)生的時間過

23、程如下：Sporo 珠的孢子通過P spoIVB或P sspK的激活導(dǎo)致在分化周期結(jié)束時在前孢子中產(chǎn)生Ecf41 Bli aa1-204。隨后，由于P ydfG的激活，這將導(dǎo)致MazF的表達(dá)。對于我們已經(jīng)成熟的Sporo珠，這不會有毒，因?yàn)樗鼈兇聿恍枰g的休眠狀態(tài)。但是，在一個情況下孢粉珠逸出的萌發(fā)基于上述基因敲除STOP,自殺開關(guān),22,,孢粉珠是第一代的枯草芽孢桿菌芽孢的最外層，孢子外殼上顯示我們選擇的蛋白質(zhì)。在未來Sporo珠

24、可以作為蛋白質(zhì)顯示的平臺，因此可用于眾多通用應(yīng)用。我們的目標(biāo)是顯示枯草芽孢桿菌具有這樣的能力。作為原理證明，我們成功地將GFP融合到孢子外殼中，并用顯微鏡獲得熒光。,孢粉珠顯示蛋白,23,評估孢子外殼蛋白的三個啟動子（P cgeA，P cotV，P cotYZ）的結(jié)果。對于每個啟動子，評估三次獨(dú)立的克隆。為了將啟動子活性與生長期相關(guān)聯(lián)，在整個實(shí)驗(yàn)中測量光密度（OD 600）。cotZ，P cotYZ和P cotV的天然促進(jìn)劑如預(yù)期的那樣

25、在穩(wěn)定期顯示出明顯的信號。P cotYZ比P cotV早兩個小時被激活，兩個啟動子活性約12小時。相反，P cgeA沒有顯示任何活動。,評估孢子外殼蛋白的三個啟動子,24,我們使用ImageJ測量每??個孢子750像素的面積的熒光強(qiáng)度。野生型孢子幾乎沒有任何熒光，而這兩個孢粉珠與整合的構(gòu)建PSB 燒烤 1C-P cotYZ - cotZ -2aa - GFP終止子給周圍的孢子的邊緣明顯的熒光信號。此外，它證明菌株B70具有最高的熒光強(qiáng)度

26、?？傊?，我們成功地開發(fā)官能孢粉珠，其能夠改性的表面上顯示所選擇的任何蛋白質(zhì)的枯草芽孢桿菌內(nèi)生孢子。我們從我們的芽孢桿菌 B io B rick B ox中選擇了空載體pSB BS 1C 作為cotZ構(gòu)建體。 所有產(chǎn)生的孢粉珠通過熒光顯微鏡研究。強(qiáng)度條形圖顯示熒光強(qiáng)度，而3D圖則說明了穿過孢子表面的熒光強(qiáng)度的分布。這與我們的融合蛋白在地殼中的定位有關(guān)。對于圖像分析，我們使用ImageJ測量每個孢子750像素的面積的熒光強(qiáng)度。,孢子的熒光

27、強(qiáng)度,25,26,在我們的Sporo矢量的幫助下，我們?nèi)诤狭薆ielefeld團(tuán)隊(duì)的兩個Laccases和cgeA。我們選擇了Ecol（大腸桿菌）和Bhal（嗜堿芽孢桿菌）（Bacillus halodurans），因?yàn)樗鼈儾缓魏蝔obidden限制性位點(diǎn)（NgoMIV或AgeI for Freiburg標(biāo)準(zhǔn)RFC 25）。然而，與比勒菲爾德測試的其他漆酶相比，純化蛋白質(zhì)的活性相當(dāng)?shù)汀＋@得的菌株生長緩慢，但我們能夠用底物測試孢子的活性

28、。將該活性與野生型孢子進(jìn)行比較。結(jié)果清楚地顯示了兩種Laccase-活動孢粉珠。與Bielefeld的結(jié)果一致，Bhal的活性高于Ecol。對于我們來說，這證明酶顯示在表面上，它仍然工作，它可以進(jìn)入底物！此外，可以清楚地測量活性，盡管這些不是最佳漆酶。凈化方法由于孢子在的Difco（培養(yǎng)基）中生長24小時后，留下了一些營養(yǎng)細(xì)胞，我們希望凈化孢粉珠。我們嘗試了這種方法的三種不同的方法：用法國壓力機(jī)，超聲處理和溶菌酶處理。通過顯微結(jié)果

29、，我們得出結(jié)論，溶菌酶處理是唯一成功的方法。此外，這種治療并沒有損害外殼融合蛋白，因?yàn)榫G色熒光仍然可以檢測。,孢粉珠的純化方法,27,接下來，我們在溶菌酶處理后測試了Sporobeads的熒光。這一分析顯示溶菌酶對gfp融合蛋白沒有損害，因?yàn)闊晒鉀]有改變。,,28,過濾 ——利用蛋白質(zhì)篩選,我們的孢粉珠可用于通過在其表面上表達(dá)特異性結(jié)合這些靶標(biāo)的蛋白質(zhì)來從重金屬離子，毒素和塑料中凈化水分。這種結(jié)合蛋白質(zhì)的一個實(shí)例可以是C

30、PX- 孢粉珠粒。是由2007年MIT iGEM團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一種肽，其極度疏水，因此能夠結(jié)合水中的聚苯乙烯微粒。過度使用一次性塑料和缺乏通用的回收計劃已導(dǎo)致世界海洋的污染。在海洋中，大塊塑料垃圾被海流磨碎，并被紫外線輻射降解成微小的碎片，被稱為“塑料浮游生物”，被魚，過濾器飼料和其他海洋生物所消耗。這種塑料吸收會導(dǎo)致中毒，不育和死亡。在巨大的過濾系統(tǒng)，CPX- 孢粉珠，其不能發(fā)芽，可以被放置就位以過濾微觀塑料顆粒出來的水。這種特定的過濾

31、將優(yōu)于毯式過濾系統(tǒng)，其也去除了對海洋生態(tài)系統(tǒng)重要的浮游植物。,29,表達(dá)幾乎任何感興趣的蛋白質(zhì)的能力顯示了實(shí)驗(yàn)室工作的巨大潛力。我們的孢粉珠可以例如表達(dá)TAL效應(yīng)子用于結(jié)合序列特異性DNA延伸。這可以允許對糧食作物進(jìn)行簡單的轉(zhuǎn)基因生物檢測。除了表達(dá)能夠結(jié)合化合物或感興趣的離子的蛋白質(zhì)，我們的孢粉珠也可以顯示具有酶活性的蛋白質(zhì)。在2011年華盛頓大學(xué)隊(duì)iGEM大賽開發(fā)的酶，Kumamolisin，其裂解肽。該酶的底物是引起患有腹腔疾病的個

32、體的反應(yīng)的特定氨基酸序列。這種切割酶可用于消除含麩質(zhì)食品的刺激物。孢粉矢量還有我們的許多可能的應(yīng)用孢粉珠，因?yàn)樗梢燥@示各種不同的蛋白質(zhì)其表面上。為了輕松創(chuàng)建它們，我們設(shè)計了一個孢粉向量，只需在其中插入編碼您選擇的融合蛋白的基因即可。,其他應(yīng)用,30,1.即使在惡劣的環(huán)境條件下也非常穩(wěn)定2.容易和便宜地生產(chǎn)大量3.食物補(bǔ)充劑中人體營養(yǎng)的一部分， 一般被認(rèn)為是安全的。此外，我們的孢粉珠無法增殖，因此很可能不被法律視為轉(zhuǎn)基因生物4.