枯草芽孢桿菌lipA基因表達(dá)元件的修飾.pdf

1、在微生物的基因工程育種中，使用強(qiáng)啟動(dòng)子和穩(wěn)定子表達(dá)目的基因，可以獲得高水平的表達(dá)效果。本文選擇噬菌體Φ29的A1啟動(dòng)子和枯草芽孢桿菌aprE基因的穩(wěn)定子，構(gòu)成一個(gè)新的表達(dá)盒，用于在枯草芽孢桿菌DB104染色體上替換lipA基因原有的表達(dá)元件。本文主要對(duì)lipA基因表達(dá)元件原位修飾的基因操作方法進(jìn)行了研究。
　　 采用重疊PCR方法，將兩個(gè)lipA基因同源片段和紅霉素抗性基因片段拼接，得到重組片段LE：LE與質(zhì)粒pEASY-T1載

2、體連接，在大腸桿菌中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pT1-LE；轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DB104，篩選得到了具有紅霉素抗性的lipA基因缺陷菌株DB104E。構(gòu)建了帶有野生型lipA基因片段的重組質(zhì)粒pT1-LA，用于轉(zhuǎn)化DB104E，可以恢復(fù)lipA基因的缺陷；并發(fā)現(xiàn)lipA+菌株可以在橄欖油基本培養(yǎng)基上生長，而lipA-菌株則不能生長，橄欖油基本培養(yǎng)基能夠用于篩選lipA+的轉(zhuǎn)化子。通過重疊PCR方法，將A1啟動(dòng)子序列、aprE穩(wěn)定子序列和上下游lipA

3、基因同源序列拼接，得到了重組片段LPAS，與質(zhì)粒pEASY-T1 Simple連接，在大腸桿菌中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pT1-PAs；通過對(duì)質(zhì)粒pT1-PAs的測(cè)序，證明A1啟動(dòng)子序列和aprE穩(wěn)定子序列按照預(yù)定設(shè)計(jì)拼接成一個(gè)表達(dá)盒；但質(zhì)粒pT1-PAs轉(zhuǎn)化DB104E，在橄欖油基本培養(yǎng)基上不能篩選出轉(zhuǎn)化子，推測(cè)因?yàn)榭赡苁潜磉_(dá)盒沒有功能，或者轉(zhuǎn)化方法存在問題。為了證明在pT1-PAs轉(zhuǎn)化過程中基因重組確實(shí)發(fā)生，采用酶切連接的方法，將氯霉素抗性基