枯草芽孢桿菌植酸酶的性質(zhì)研究及產(chǎn)酶基因的克隆和序列分析.pdf

1、該研究從118份樣品中分離到一株產(chǎn)植酸酶的枯草芽孢桿菌(命名為Bacillus. subtilisWHNB02),其發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀、硫酸銨分級沉淀及Sephadex G-100柱層析等步驟后分離純化了該酶,純化倍數(shù)約為31.5倍,回收率為13.0﹪.酶學(xué)性質(zhì)研究表明:該酶為單體酶,SDS-PAGE測得的表觀分子量約為42KD;37℃下以植酸鈉為底物的Km值為0.5mmol/L;酶反應(yīng)的最適溫度為60℃,80℃作用10min剩余酶活為6

2、1﹪;最適pH為7.0,在pH6.0~10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定;酶活性及穩(wěn)定性都依賴Ca<'2+>存在,螯合劑及各種金屬離子對酶活都有不同程度的抑制作用.1mM的Hg<'2+>、Mn<'2+>、Cu<'2+>、Zn<'2+>、Ba<'2+>有中度抑制作用,1mM的EDTA、Cd<'2+>具有很強的抑制作用,剩余酶活在20﹪以下.根據(jù)國際基因庫(GenBank)中注冊的芽孢桿菌植酸酶phyC基因序列設(shè)計了一對引物,PCR擴增獲得了一條長約1.2

3、kb的特異性PCR擴增條帶.將此PCR擴增片段定向克隆到pUC18質(zhì)粒的多克隆位點,構(gòu)建了含有目的基因片段的重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌載體菌中獲得了陽性克隆菌株.重組質(zhì)粒中外源片段的DNA序列測定表明,該片段含有植酸酶phyC基因的完整序列,基因全長1152bp,編碼383個氨基酸,5'端有一編碼26個氨基酸的信號肽序列.將該基因與Kerovuo(1998)所報道的芽孢桿菌植酸酶phyC基因(GenBank Accession