家蠶乙醇脫氫酶的分子克隆及枯草芽孢桿菌子表面展示.pdf

1、乙醇脫氫酶屬于氧化還原酶家族,能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為輔酶,催化伯醇和醛之間的可逆反應。乙醇脫氫酶在很多生理過程中都起著重要作用,參與例如類固醇、類維生素A、脂質過氧化產(chǎn)物、脂肪酸、乙醇等代謝過程。目前,人們已經(jīng)鑒定了多種生物的乙醇脫氫酶基因,但是家蠶乙醇脫氫酶基因(Bombyx mori alcohol dehydrogenases,BmADH)還未見相關的報道。
　　 本研究首

2、先對家蠶乙醇脫氫酶基因BmADH進行了生物信息學分析,并使其在大腸桿菌中表達,通過檢測酶活性發(fā)現(xiàn)BmADH蛋白活力易受pH、溫度影響。為了獲得在極端條件下催化活性更高的酶蛋白,本研究借助枯草芽孢桿菌在極端的溫度、干燥以及暴露于有機溶劑和其他毒性化學物質等不利條件下能長期存活的性質,首次利用分子生物學方法將家蠶乙醇脫氫酶展示在枯草芽孢桿菌芽孢表面,獲得融合蛋白CotC-BmADH。研究結果如下:
　　 1.通過生物信息學方法分析了

3、家蠶BmADH,結果表明,該基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子,開放閱讀框全長822 bp,編碼274個氨基酸,預測分子量約為29.6 kDa,等電點約為8.21。
　　 2.設計引物通過PCR擴增出了家蠶BmADH編碼序列,克隆并利用pET-30a表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,所得融合蛋白通過質譜和Western blotting鑒定為目標蛋白。經(jīng)Ni-NTA純化系統(tǒng)純化后用于免疫新西蘭大白兔,制備抗BmADH蛋

4、白的血清。
　　 3.使用紫外分光光度計檢測經(jīng)過非變性純化后的重組家蠶BmADH在不同pH值和溫度條件下的酶活力。檢測結果表明,BmADH對環(huán)境條件敏感,如遇pH值或溫度不適則活力明顯降低甚至失活。
　　 4.將家蠶乙醇脫氫酶基因BmADH與芽孢表面蛋白基因CotC重組,構建融合表達CotC-BmADH韻整合型重組質粒pJS700-BmADH。
　　 5.用融合表達BmADH的重組質粒轉化Bacillus sub