代謝工程改造枯草芽孢桿菌-谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)手性2,3-丁二醇和乙偶姻.pdf

1、本文首先對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行代謝工程改造，并結(jié)合輔因子工程和發(fā)酵工程優(yōu)化的策略，研究了枯草芽孢桿菌分別生產(chǎn)手性D-(-)-和meso-2,3-丁二醇的能力；其次，利用輔因子工程手段，解決了枯草芽孢桿菌生產(chǎn)乙偶姻時(shí)還原力過剩的問題，實(shí)現(xiàn)了乙偶姻的高產(chǎn)，并達(dá)到了較高的生產(chǎn)速率；最后，通過在谷氨酸棒桿菌中引入外源的2,3-丁二醇合成路線，獲得了高產(chǎn)D-(-)-2,3-丁二醇的工程菌株。
　　首先，通過文獻(xiàn)比對(duì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，解釋了本實(shí)驗(yàn)中

2、B.subtilis168生產(chǎn)單一手性D-(-)-2,3-丁二醇的合理性。為了提高D-(-)-2,3-丁二醇的產(chǎn)量和得率，本文對(duì)乙偶姻的合成途徑、競(jìng)爭(zhēng)途徑、還原力供給和發(fā)酵條件等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在微氧條件下，敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldh可以阻斷副產(chǎn)物乳酸的生產(chǎn)，同時(shí)為菌株提供更多可利用的NADH。通過引入來自大腸桿菌中udhA編碼轉(zhuǎn)氫酶，可以將胞內(nèi)PP途徑生產(chǎn)的NADPH部分轉(zhuǎn)化為NADH供乙偶姻還原酶將乙偶姻還原為D-(-

3、)-2,3-丁二醇。通過胞內(nèi)還原力水平和乙偶姻還原酶活力的測(cè)定，以及不同工程菌株乙偶姻和D-(-)-2,3-丁二醇的生產(chǎn)情況，確定對(duì)于枯草芽孢桿菌胞內(nèi)可利用的NADH對(duì)2,3-丁二醇的生產(chǎn)有關(guān)鍵作用，而單純提高乙偶姻還原酶的活性對(duì)提高D-(-)-2,3-丁二醇的生產(chǎn)的作用并不顯著。最終獲得工程菌株BSF30，通過發(fā)酵條件優(yōu)化在分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中生產(chǎn)了101.2g/L的D-(-)-2,3-丁二醇。通過引入來自肺炎克雷伯氏菌編碼meso-2

4、,3-丁二醇脫氫酶的budC基因，并結(jié)合代謝工程、輔因子工程和發(fā)酵工程策略，構(gòu)建了高產(chǎn)meso-2,3-丁二醇的工程菌株BSF9G，在分批補(bǔ)料發(fā)酵中生產(chǎn)了103.7g/Lmeso-2,3-丁二醇。通過解調(diào)阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，并引入來自大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖木糖和阿拉伯糖的共利用。
　　其次，通過輔因子工程策略，確定了使用高溶氧水平的策略，在47℃較高的發(fā)酵溫度條件下，工程菌株在12h發(fā)酵時(shí)間內(nèi)可以生產(chǎn)6

5、3.2g/L乙偶姻，得率達(dá)到理論最大得率的94.5％，生產(chǎn)速率為5.32g/(L-h)。如果將發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至16h，乙偶姻的濃度可以達(dá)到67.6g/L。
　　最后，通過在谷氨酸棒桿菌中引入來自枯草芽孢桿菌的2,3-丁二醇合成路線，過表達(dá)了來自大腸桿菌的轉(zhuǎn)氫酶，并敲除了主要副產(chǎn)物甘油和乙酸的合成途徑編碼基因，獲得了高產(chǎn)D-(-)-2,3-丁二醇的工程菌株。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，在分批補(bǔ)料發(fā)酵中生產(chǎn)了60.2g/L的D-(-)-2,3-丁