代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的研究.pdf

1、本研究通過對中心碳代謝途徑、血紅素合成途徑、細胞壁的合成途徑以及甘氨酸途徑的改造，研究了谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的潛力。
　　首先，通過克隆來自類球紅細菌的5-氨基乙酰丙酸合酶基因（hemA）在谷氨酸棒桿菌中實現(xiàn)了5-ALA的積累；其次，通過失活乙酸乳酸生成途徑，進一步提高了5-ALA的產(chǎn)量；隨后，通過改造回補途徑，5-ALA的產(chǎn)量達到了2.06g/L；進一步失活琥珀酰CoA競爭途徑不能有效提高5-ALA的產(chǎn)

2、量。
　　5-ALA的合成是血紅素合成途徑的限速步驟，為了研究血紅素合成途徑相關基因?qū)?-ALA積累的影響，首先單獨過表達了hemC、hemD、hemE和hemN基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用低拷貝質(zhì)粒pEP2過表達hemD基因可以使5-ALA的產(chǎn)量提高29.2％；下調(diào)hemH基因和hemY基因的表達水平可以分別使5-ALA的產(chǎn)量提高14.0%和5.3%。
　　細胞壁對5-ALA的分泌影響很大，而青霉素結(jié)合蛋白在細胞壁的合成過程中起著重

3、要的作用。本文分別敲除了四個編碼高分子量青霉素結(jié)合蛋白的基因（包括pbp1a，pbp1b，pbp2a和pbp2b）。結(jié)果表明，單獨敲除pbp1a，pbp1b以及pbp2b可以使5-ALA的產(chǎn)量分別提高13.5%，29.5%和22.2%。
　　為了進一步加速5-ALA的分泌，本文利用低拷貝質(zhì)粒pEP2分別過表達了不同來源的蘇氨酸運輸?shù)鞍拙幋a基因。研究發(fā)現(xiàn)，過表達來自大腸桿菌的rhtA基因可以加速5-ALA的運輸，獲得的工程菌C.gl

4、utamicum R1生產(chǎn)5-ALA的能力提高了18.5%。本文考察了不同發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件對C.glutamicum R1生產(chǎn)5-ALA的影響，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件，C.glutamicum R1能夠生產(chǎn)3.40g/L5-ALA。在添加青霉素的條件下，C.glutamicum R1在5L發(fā)酵罐中能夠生產(chǎn)10.43g/L5-ALA。
　　為了增強甘氨酸合成途徑的通量，本文對該途徑進行了代謝工程改造。在不添加甘氨酸的情

5、況下，過表達谷氨酸棒桿菌本身的絲氨酸操縱子serAΔ197CB可以使5-ALA的產(chǎn)量提高69.2%；進一步敲除L-絲氨酸脫氨酶編碼基因sdaA使5-ALA的產(chǎn)量明顯降低；在過表達絲氨酸操縱子的基礎上過表達glyA基因獲得工程菌C.glutamicum AG3，該菌株生產(chǎn)5-ALA的能力提高了1.48倍。對甘氨酸合成途徑的改造也可以提高工程菌在添加甘氨酸情況下生產(chǎn)5-ALA的能力，在同樣添加7.5g/L甘氨酸的情況下，C.glutamic