代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)γ-氨基丁酸.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)作為一種在自然界廣泛分布的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有很多重要的功能和作用，可以被應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。其主要制備方法主要有微生物發(fā)酵法、植物富集法和化學(xué)合成法三種。本論文主要利用野生型大腸桿菌E.coil K12作為出發(fā)菌株，通過基因工程手段改造GABA的代謝途徑，以提高工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量。主要研究如下:
　　1.利用Red同源重組技術(shù)來敲除與大腸桿菌K

2、12中GABA分解途徑相關(guān)的三個基因gabT、gabP、puuE。構(gòu)建同源臂75bp左右的打靶線性片段，在質(zhì)粒pKD46表達Exo、Beta和Gam3種酶的作用下，敲除gabT基因，再導(dǎo)入質(zhì)粒pCP20，pCP20可以編碼能夠識別FLP位點特異性重組酶，消除目的基因位置上的抗性基因，再利用目的基因位置兩側(cè)的鑒定引物進行PCR，得到的產(chǎn)物片段的鑒定gabT基因敲除成功。得到基因敲除菌株E.coli K12△gabT，隨后以E.coliK1

3、2△gabT作為出發(fā)菌株，成功敲除其gabP基因，得到基因敲除菌株E.coliK12△gab T△gabP，最后以E.coli K12△gabT△gabP作為出發(fā)菌株，成功敲除其puuE基因，得到基因敲除菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE。
　　2.將與GABA合成途徑相關(guān)的三個基因gadA、gadB、gadC構(gòu)建到質(zhì)粒ptrc99A上，利用雙酶切和測序?qū)ζ桨迳仙L出來的轉(zhuǎn)化子進行鑒定，得到重組質(zhì)粒ptrc99

4、A-gadABC，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入基因敲除菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE，得到工程菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE/ptrc99A-gadABC。在搖瓶水平上，進行發(fā)酵產(chǎn)GABA。與原始菌株GABA的產(chǎn)量0.11g/L相比，工程菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE發(fā)酵產(chǎn)GABA的產(chǎn)量提升到0.73g/L，證明了敲除三種基因提升GABA產(chǎn)量的可行性。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入基因敲除菌株

5、中，菌株E.coliK12△gabT△gabP△puuE/ptrc99A-gadABC發(fā)酵產(chǎn)GABA，其產(chǎn)量為6.4g/L，與基因敲除菌株相比，GABA產(chǎn)量大大提高，進一步證明基因工程手段改造GABA代謝途徑的成功。
　　3.對工程菌株E.coli K12△gabT△gabP△puuE/ptrc99A-gadABC的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化。首先展開單因素實驗，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成成分和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，隨后在此基礎(chǔ)上進行P

6、B試驗，選出發(fā)酵培養(yǎng)基中影響GABA產(chǎn)量的關(guān)鍵因子，分別為底物濃度，葡萄糖濃度和胰蛋白胨濃度。在此基礎(chǔ)上，進行響應(yīng)面試驗，得到當三個關(guān)鍵因子達到最佳值，分別為谷氨酸鈉濃度34.59g/L，葡萄糖濃度8.97g/L，胰蛋白胨濃度24.47g/L時，GABA產(chǎn)量達到最大值為19.38g/L。得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖8.97g/L，酵母粉16g/L，胰蛋白胨24.47g/L，L-谷氨酸34.59g/L，硫酸銨5g/L，磷酸鹽40mM