產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌代謝工程的研究.pdf

1、本文通過敲除ptsG基因和構(gòu)建不同的質(zhì)粒得到一系列產(chǎn)琥珀酸的Escherichia coli基因工程菌,研究了在大腸桿菌中磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)、半乳糖協(xié)同運輸體系和磷酸戊糖途徑的葡萄糖脫氫酶對大腸桿菌琥珀酸合成的影響,成功地通過敲除ptsG基因和擴增galp、glk、gdh基因改變了工程菌株琥珀酸的合成能力.最后本文建立了Escherichia coli的厭氧生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),對野生型大腸桿菌W1485和ptsG敲除菌株TLIQ2和TU

2、Q2/pQZ3的代謝通量分布作了比較分析.得到的主要結(jié)果如下: 利用Red同源重組技術(shù),構(gòu)建ptsG基因缺陷株TLJQ2在厭氧情況下,敲除菌株nJQ2的琥珀酸產(chǎn)量是原始菌株W1485的5倍,乳酸、甲酸、乙酸和乙醇這些主要副產(chǎn)物的產(chǎn)量都有不同程度的下降. ptsG基因的缺失能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量,但它會減慢葡萄糖的吸收速率,從而導(dǎo)致菌株的生長緩慢.因此我們構(gòu)建了質(zhì)粒pQZ3和pQZ4,分別表達了galp和glk兩個基因,而當

3、大腸桿菌用半乳糖協(xié)同運輸體系時,借助半乳糖滲透酶(galp)運輸糖到胞內(nèi),同時葡萄糖激酶(glk)將其磷酸化,提高了厭氧發(fā)酵時葡萄糖的吸收速率和菌體細胞生長速率,但合成琥珀酸的能力沒有變化. 通過NADH的再生提供更多的還原力可以使琥珀酸的轉(zhuǎn)化率得到提高,即提高大腸桿菌產(chǎn)NADH的能力.從枯草芽孢桿菌.Bacillus subtilis 168中克隆出葡萄糖脫氫酶基因片段,整合到質(zhì)粒pET28a(+)中并在大腸桿菌在中進行表達,