產(chǎn)延胡索酸大腸桿菌代謝途徑的改造.pdf

1、本文以琥珀酸產(chǎn)量較高的大腸桿菌SPUEC101為出發(fā)菌株，首先敲除延胡索酸還原酶基因（frdB），以阻斷其催化延胡索酸向琥珀酸轉(zhuǎn)化途徑，得到可以產(chǎn)延胡索酸的菌株SPUEC103，為了進(jìn)一步提高重組大腸桿菌產(chǎn)延胡索酸的含量，本文對其生長特性進(jìn)行了相關(guān)研究并對其代謝途徑繼續(xù)改進(jìn)，本文通過表達(dá)枯草芽孢桿菌的丙酮酸羧化酶（pyc）、敲除編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）中葡萄糖專性跨膜蛋白IICBGIc的基因（ptsG）等途徑對其進(jìn)行改造，研究發(fā)現(xiàn)表

2、達(dá)pyc后能夠提高延胡索酸的產(chǎn)量，敲除ptsG基因也取得了一定的效果，但同時(shí)重組菌株的生長能力和葡萄糖的利用效率都有所降低。實(shí)驗(yàn)證明在重組大腸桿菌中敲除frdB和ptsG，同時(shí)表達(dá)枯草芽抱桿菌的pyc基因是可以產(chǎn)延胡索酸的，但是產(chǎn)量還不夠高，菌株生長狀況也不大理想，需要進(jìn)一步的研究改造。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以溴甲酚綠平板初篩、琥珀酸定性半定量篩選和HPLC最終篩選，建立了一套簡單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的科學(xué)篩選產(chǎn)琥珀酸菌株的方法，

3、并通過此方法確定了一株琥珀酸產(chǎn)量達(dá)5.16g/L的菌株，經(jīng)鑒定為大腸桿菌，命名為SPUEC101。⑵通過敲除延胡索酸還原酶frdB來阻斷此轉(zhuǎn)化從而實(shí)現(xiàn)延胡索酸的積累，發(fā)酵結(jié)果顯示琥珀酸積累明顯下降，由5.47 g/L下降為2.62 g/L，下降了52.1％，并且延胡索酸開始有少量積累，但其產(chǎn)量較低僅為0.182 g/L。由此，可以初步得出結(jié)論，frdB的敲除可以使大腸桿菌積累一定量的延胡索酸，但不能大量積累延胡索酸。⑶將丙酮酸羧化酶表達(dá)

4、載體 pET-28a(+)-pyc導(dǎo)入 frdB敲除菌SPUEC103△frdB中成功構(gòu)建了SPUEC107/pyc△frdB。實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)pyc基因之后，能夠改善大腸桿菌敲除frdB基因后生長能力減弱的狀況，同時(shí)還可以提高其葡萄糖利用率。在frdB敲除菌SPUEC103△frdB中表達(dá)丙酮酸羧化酶之后，琥珀酸含量由2.62g/L增加到4.33g/L，提高了65.3%，延胡索酸含量由0.182g/L增加到0.254g/L，提高了39.6

5、%。⑷對SPUEC107/pyc△frdB進(jìn)行改造，利用Red同源重組技術(shù)敲除了其ptsG基因，成功構(gòu)建了SPUEC108/pyc△frdB△ptsG。實(shí)驗(yàn)表明，與菌株SPUEC107對比SPUEC108敲除ptsG基因后，重組大腸桿菌的生長能力和葡萄糖的利用率都有所降低，產(chǎn)酸分布也有所改變，具體表現(xiàn)為：琥珀酸含量由琥珀酸由原來的4.33g/L上升到4.83g/L提高了11.5%，延胡索酸含量由0.254g/L上升到0.286g/L提高