大豆異黃酮代謝途徑在大腸桿菌中的構建與表達.pdf

1、大豆異黃酮(Soybean Isoflavones，SiF)具有多重保健與藥理作用，是近年來各相關領域的研究熱點。從大豆中分離提取異黃酮一直是大豆異黃酮的主要獲得途徑。作為植物天然次生代謝物，大豆異黃酮在大豆中含量并不高，且植物生長周期較長，因此只靠從大豆中提取異黃酮比較有限。隨著大豆基因組研究和現(xiàn)代生物技術的不斷進展，使利用基因工程手段構建工程菌發(fā)酵生產(chǎn)大豆異黃酮成為可能，為尋找大豆異黃酮新的來源開拓了新的方法和思路，具有重要意義。

2、 本文以經(jīng)過紫外線誘導的大豆葉片為材料，利用SMART(Switching Mechanism At 5′end of theRNA Tanscript)思想和方法構建大豆葉片全長cDNA文庫，并直接以一級庫液稀釋液為模板進行PCR，快速克隆得到異黃酮代謝途徑相關的6個全長基因，測序結(jié)果表明各基因序列都是正確的。 將基因與pET質(zhì)粒連接構建了各個單基因表達載體，在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進行誘導表達，通過

3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，除c4h基因外都得到了特異性表達蛋白。對CHS進行質(zhì)譜定性分析表明，在p<0.05水平上，蛋白匹配分值為84，證明所表達的特異性蛋白是大豆查爾酮合成酶(CHS)。 在各個單基因表達載體的基礎上，構建了多基因表達載體，使除c4h外的5個基因由兩個載體攜帶導入到E.coli BL21(DE3)中，各基因前都帶有相應的T7啟動子和核糖體結(jié)合位點(Ribosome Bind Site,RBS)。實驗結(jié)果表

4、明，在一定條件下攜帶多基因的雙質(zhì)粒穩(wěn)定共存的時間較長，足夠進行代謝及發(fā)酵研究。重組菌株經(jīng)IPTG誘導，以酪氨酸為底物進行發(fā)酵研究，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過HPLC測定，結(jié)果表明和空白對照相比有新的代謝產(chǎn)物生成，初步斷定為異黃酮類化合物：利用二級質(zhì)譜分析重組菌株代謝產(chǎn)物，證明其中有大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物雌馬酚。進一步鑒定實驗還在進行中。 本文采用基因工程手段，將完整的大豆異黃酮代謝途徑在大腸桿菌進行了構建，并進行了發(fā)酵和表達研究，得到了可以代謝