產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的構(gòu)建和發(fā)酵性能研究.pdf

1、琥珀酸是一種重要的化工產(chǎn)品,廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及精細(xì)化工等領(lǐng)域,市場(chǎng)前景巨大。相比于傳統(tǒng)的化學(xué)生產(chǎn)法,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸具有無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)和潛力,引起了國(guó)內(nèi)外眾多研究機(jī)構(gòu)的高度關(guān)注。其中運(yùn)用基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),由于野生大腸桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中琥珀酸含量低,且有大量副產(chǎn)物。要達(dá)到高產(chǎn)琥珀酸的目的,就必須為其進(jìn)行代謝途徑的改造,阻斷代謝支路,引導(dǎo)碳流更快更多的流向目標(biāo)產(chǎn)物。
　　 本

2、文利用Xer/dif重組酶系統(tǒng),對(duì)一株野生大腸桿菌Escherichia coli CICIM B0013開(kāi)展了代謝途徑的調(diào)控研究。首先為了消除發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的雜酸等副產(chǎn)物,本文敲除了E.coli CICIM B0013琥珀酸代謝競(jìng)爭(zhēng)途徑中包括乙酸激酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(ackA-pta)、乳酸脫氫酶基因(ldhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB),乙醇脫氫酶基因(adhE)在內(nèi)的關(guān)鍵酶基因,所得到的重組菌株E.coli B0013

3、-1040具備厭氧條件下高效轉(zhuǎn)化葡萄糖生成琥珀酸的能力,發(fā)酵液中無(wú)乙酸,甲酸等副產(chǎn)物生成。
　　 其次本文在琥珀酸代謝支路已被阻斷的大腸桿菌菌株基礎(chǔ)上又進(jìn)行了葡萄糖吸收方式的調(diào)整研究。為關(guān)閉其葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS),敲除了該系統(tǒng)中關(guān)鍵酶ⅡCBGlc。的編碼基因ptsG,促使半乳糖協(xié)同運(yùn)輸系統(tǒng)成為大腸桿菌葡萄糖運(yùn)輸?shù)闹饕緩?。這項(xiàng)改變大大增加了琥珀酸的合成前體PEP,得到的重組菌株E.coli B0013-1050經(jīng)發(fā)酵實(shí)

4、驗(yàn)結(jié)果顯示產(chǎn)琥珀酸能力得到了大幅度提升。厭氧轉(zhuǎn)化36 h琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到30.5 g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為0.85 g/L·h,葡萄糖.琥珀酸糖酸轉(zhuǎn)化率為65.2％,發(fā)酵液經(jīng)HPLC未檢測(cè)到乙酸等雜酸。另外,ptsG基因的缺失也解除了葡萄糖代謝產(chǎn)物對(duì)菌體的抑制,使大腸桿菌可以同時(shí)利用葡萄糖以外的多種碳源,很大程度上拓寬了琥珀酸發(fā)酵的底物譜,為降低生產(chǎn)成本,大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。
　　 為加強(qiáng)琥珀酸合成途徑,引導(dǎo)代謝流更多的流向草酰

5、乙酸這一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),本文強(qiáng)化表達(dá)了PEP羧化酶。通過(guò)將大腸桿菌內(nèi)源ppc基因與不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的連接,導(dǎo)入重組菌,從而使實(shí)現(xiàn)對(duì)ppc基因在宿主體內(nèi)表達(dá)劑量的控制。研究發(fā)現(xiàn)在琥珀酸生產(chǎn)過(guò)程中,PEP羧化酶的表達(dá)劑量并非越高越好,而是需要控制在一個(gè)合理的水平才能有效促進(jìn)琥珀酸的積累。實(shí)驗(yàn)中得到的重組菌E.coli B0013-1050(pTH-ppc)是所有重組菌中生產(chǎn)能力最強(qiáng)的一株,厭氧轉(zhuǎn)化葡萄糖36 h琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到36.2 g/L,生產(chǎn)強(qiáng)