植物乳桿菌γ-氨基丁酸產(chǎn)量影響因素及代謝途徑的研究.pdf

1、許多植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）都是重要的益生乳酸菌，因其具有優(yōu)良的發(fā)酵特性和卓越的益生功能而廣泛地被應(yīng)用于乳制品中，尤其在發(fā)酵乳制品中更為常見(jiàn)。γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)是哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血壓、鎮(zhèn)靜安神、促進(jìn)胰島素分泌、保護(hù)肝腎機(jī)能、預(yù)防肥胖等功能。
　　本課題以Lb.plantarum的模式菌株Lb.plantarum

2、ATCC14917為研究對(duì)象，首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，以GABA產(chǎn)量為指標(biāo)研究了影響菌體積累GABA的因素;再通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定各因素對(duì)GABA產(chǎn)量影響的顯著程度。其次，以L-谷氨酸鈉(monosodium L-glutamate，L-MSG)為單一誘導(dǎo)因素，化學(xué)限定培養(yǎng)基為發(fā)酵基質(zhì)，建立了能夠誘導(dǎo)GABA產(chǎn)量顯著升高的發(fā)酵體系;最后，對(duì)特定時(shí)間點(diǎn)GABA產(chǎn)量差異最為明顯的菌體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)與GABA產(chǎn)量差異存在密切聯(lián)系的基因進(jìn)行定

3、量分析、功能注釋、代謝通路富集等相關(guān)生物學(xué)信息分析，從而預(yù)測(cè)由L-MSG誘導(dǎo)的，Lb.plantarum ATCC14917中GABA的代謝途徑。
　　通過(guò)上述研究得到以下結(jié)果:
　　1、L-MSG濃度、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)濃度、發(fā)酵初始pH值、發(fā)酵溫度能夠顯著影響菌體積累GABA，但鈣離子濃度對(duì)其產(chǎn)量影響不大;正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定上述五個(gè)因素對(duì)GABA產(chǎn)量影響的顯著程度為:發(fā)酵初始pH值

4、＞發(fā)酵溫度＞L-MSG濃度＞PLP濃度＞Ca2+濃度。
　　2、以L-MSG為單一誘導(dǎo)因素，建立的GABA產(chǎn)量顯著升高的發(fā)酵體系為發(fā)酵初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度為37℃，L-MSG濃度為100 mM，接種量為3％，培養(yǎng)基體積為2L。在此條件下，發(fā)酵36 h時(shí)，添加L-MSG發(fā)酵液中GABA含量為721.35 mM，是未添加L-MSG發(fā)酵液中GABA含量的7.77倍。
　　3、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到了由L-MSG誘導(dǎo)、表達(dá)量存

5、在明顯變化的87個(gè)差異基因，其中有69個(gè)顯著上調(diào)基因和18個(gè)顯著下調(diào)基因，主要包括磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因、丙酮酸脫氫酶編碼基因、GAD編碼基因、GABA轉(zhuǎn)氨酶編碼基因、琥珀酸半醛脫氫酶編碼基因等。這些差異基因分別與碳水化合物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶等功能密切相關(guān)，同時(shí)參與丙酮酸代謝、戊糖磷酸途徑、脂肪酸合成、氨基酸代謝等與GABA代謝相關(guān)的生物化學(xué)過(guò)程。
　　4、經(jīng)差異基因的功能注釋和代謝通路富集分析，預(yù)測(cè)了L-MSG誘導(dǎo)Lb

6、.plantarumATCC14917大量積累GABA可能的分子機(jī)制如下:①L-MSG誘導(dǎo)GAD編碼基因gadB上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)L-MSG大量轉(zhuǎn)化成GABA;②L-MSG誘導(dǎo)GABA轉(zhuǎn)氨酶編碼基因gabT下調(diào)表達(dá)，抑制GABA的分解途徑，有助于GABA的積累;③L-MSG誘導(dǎo)葡萄糖經(jīng)糖酵解、丙酸代謝等途徑生成琥珀酸，琥珀酸可抑制GABA的分解途徑，有助于GABA的積累;④L-MSG激活了細(xì)胞質(zhì)中脂肪酸的合成，增加了細(xì)胞膜的通透性，有助于細(xì)

7、胞對(duì)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝。
　　本課題研究了影響Lb.plantarum ATCC14917積累GABA的主要因素，并利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)錄組水平上探究Lb.plantarum ATCC14917生成GABA的分子機(jī)制，同時(shí)預(yù)測(cè)了GABA的代謝途徑。本研究為從分子水平上調(diào)控Lb.plantarum發(fā)酵合成GABA、提高GABA的產(chǎn)量奠定了重要的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他種屬乳酸菌GABA合成機(jī)理和代謝途徑的